应用实时荧光pr技术进行禽流感灭活疫苗的亚型鉴定.pdf

摘 要 疫苗免疫是我国控制禽流感的一项重要措施，我国政府对禽流感疫苗的质量非常重视， 严把疫苗质量关，加强市场监管，是我所的一项重要职能，建立快速，敏感、特异的疫苗质 量检测方法，特别是各亚型的鉴别检测方法，对及时进行产品质量控制和市场监督有着重要 意义。为此，我所专门承担国家禽流感科技攻关课题开展此项研究。本实验旨在利用荧光定 量PCR方法对H5、聃、H7亚型禽流感灭活疫苗进行亚型快速鉴别检测，为该产品的质量控制 和市场监督提供技术支持。 针对H5亚型禽流感病毒血凝素(姒)基因的保守序列，设计和合成了特异性的引物和 Taqman粥B探针，利用实时荧光定IPCR技术，检测H5亚型禽流感灭活疫苗．对鹏、H7亚型 禽流感疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应，特异性好。组内和组闻实验显示重复性良好。同时 构建了包含}IA基因的标准质粒，进行体外转录并进行梯度稀释，得到一系列已知梯度浓度的 矾^标准品，用其绘制标准曲线，表明该方法的灵敏度为10拷贝／反应。标准曲线的相关系数 number Copy 为0．998003，起始拷贝数与ct值之问的线性关系表达式；Ct=一3．347424×Log +35．885406，通过荧煳动力学曲线可以测定出疫苗样品(病毒)的ct值，代入方程，即 可以得出疫苗样品(病毒)的}IA基因拷贝数。 对50批H5亚型禽流感灭活疫苗进行了荧光定量PCR检测，测定了疫苗的姒基因拷贝数， 并对这50批疫苗进行了疫苗的}IA基因拷贝数与HI抗体效价之间相关性的分析，结果显示不相 关。表明IlA基因拷贝数测定取代HI抗体效价测定来判定禽流感灭活疫苗的免疫效力是不可行 的，但是该方法可以定量检测组织，尿囊液等的AIV。通过测定AIV的HA基因拷贝数。即可 以知道AⅣ的具体数目，有其现实意义。 针对H9亚型禽流感病毒血凝素(卧)基因的保守序列，设计和合成了特异性的引物和 Taqman％B探针，利用实时荧光定量PCR技术。检测H9亚型禽流感灭活疫苗。对H5、H7亚型 禽流感疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应，特异性好。重复性佳． 针对耵亚型禽流感病毒血撮素(1IA)基因的保守序列，设计和合成了特异性的引物和 TaqmanMGB探针，利用实时荧光定量PCR技术，检测H7亚型禽流感灭活疫苗。对H5、鹏亚型 禽流感疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应，特异性好。重复性佳． 对鸡胚病毒分离、荧光定量PCR、普通RT-PC8检铡AIY的灵敏度作了分析比较，结果显 示：鸡胚病毒分离高于荧光定量PCR 100一1000倍左右，荧光定量PCR高于普通RT-PCR 100一】000倍左右． 所有试验表明荧光定量PCR方法既可进行禽流感灭活疫苗亚型鉴别和快速检测，又可用 于禽流感病毒的快速定性定量检测，是一种特异、敏感，快速和简洁的定性、定量检测方法。 关键词：禽流感灭活疫苗，荧光定量PCR，H5、H9、H7亚型，鉴别检验，RNA标准品 2 Abstract all withvaccinelS measureto theoutbreakofavian Immunity Important prevent influenza(AI)．Chineseattaches tothe of^I governmentgreatimportancequality of all the vaccine is functionofour vaccine．Strengthen8upervlslouqualityimportant