氧浓度及Notch通路对大鼠纤维环细胞增殖和细胞周期的影响.pdfVIP

脊柱外科杂志，2015年O2月 ，第 13卷 1期 JSpinalSurg，February2015，Vol13，Nol ·51· 持软骨细胞的增殖过程，而在其分化过程中Notch 胞达到完全汇合。细胞生长完全汇合以后进行传 信号及靶基因Hes5表达下调 。低氧微环境可以 代。本研究均使用单层培养的第三代AFCs。 抑制骨髓间充质干细胞 向成骨细胞分化 ，在这一过 1．2．2 大鼠AFCs甲苯胺蓝染色 程中Notch信号通路被激活，Notch1表达上调；阻断 细胞爬片成功后去除培养液，PBS冲洗 3次， Notchl表达后骨髓间充质干细胞 向成骨细胞分化 4％多聚甲醛室温固定 10min；PBS冲洗 1次，滴加 的能力减弱 。目前研究证据显示体外低氧环境 甲苯胺蓝染液，室温染色30min，用 自来水轻柔润洗 可以激活 Notch信号通路从而促进椎间盘细胞增 数秒 ，蒸馏水洗2次，冷风吹干。 殖。。。但Notch受体、配体、靶基因众多，目前还未 1．2．3 实验分组 完全明确具体哪些因子参与调节了椎间盘细胞的增 将体外培养的第三代AFCs分为2组。A组：常 殖过程。本实验 旨在通过检测不同氧浓度条件下椎 氧培养组 (21％ 02，5％CO2，74％N2)；B组：低氧培 问盘纤维环细胞 (annulusfibrosuscells，AFCs)Notch 养组 (1％ 0，5％CO：，94％N：)，分别于干预后8～ 信号通路相关分子的表达变化，明确参与调节 AFCs 24h行相关检测。 增殖的相关靶基因，为进一步体外调控 AFCs增殖 1．2．4 CCK-8检测不同氧浓度干预后 AFCs增殖 和人工椎问盘构建奠定基础。 情况 1 材料和方法 将第三代 AFCs以7．5X10／TL的密度接种到 96孔板 中，加入含 10％FBS的完全培养基 ，培养 1．1 试剂与仪器 24h使细胞贴壁后加入不同浓度的Notch通路抑制 雄性 SD大 鼠购 自第二军医大学实验动物 中 剂 L685458(2~mol／L、4~mo]／L、8p~mol／L)，空 白 心，动物实验经过第二军医大学动物伦理委员会批 对照组不加入药物，阴性对照组不加纤维环细胞，每 准。DMEM／F12培养基、胎牛血清、I型胶原酶、磷 个浓度梯度设置 6个复孔，分别在常氧和低氧条件 酸盐缓冲液 (phosphatebufferedsaline，PBS)、1％青 下继续培养24h后换液，PBS冲洗各孔 1次，将 霉素／链霉素、0．25％胰酶 (含／不含EDTA，Gibco)； CCK．8试剂和完全培养基按 1：10体积 比配制成工 CO 细胞培养箱及低氧培养箱 (Thermoscientific， 作液，每孔加入 110 L，继续培养2h后用酶标仪检 USA)、倒置相差显微镜(Olympus)；4％多聚甲醛，甲 测480nm处的吸光度 (opticaldensity，OD)值。 苯胺蓝染液。RNA提取试剂 Trizol(Invitrogen)，反 1．2．5 流式细胞仪检测不同氧浓度干预后 AFCs 转录试剂盒 ReverTraAceqPCRRTKit(TOYOBO)， 细胞周期变化 PCR引物 (Invitrogen)，RealtimePCR试剂 iQSYBR 将第三代纤维环细胞以1．0X10／TL的密度接 GreenSupermix(BioRad)。CCK．8细胞活力检测试 种到6cm培养皿 中，隔天换液。待细胞生长至 剂盒 (同仁公司，13本)，酶标仪 (Bio．RAD，USA)，细 50％ ～60％融合时，加入 4p~moL／LNotch通路抑制 胞周期检测试剂盒(南京凯基生物公司)，流式细胞