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目 录 CTGF 和 TIMP-1shRNA 对 肝 纤 维 化 大 鼠 的 影 1 响………………………………………………………………1 1.1 中文摘要………………………………………………………1 1.2 英文摘要………………………………………………………3 1.3 前言……………………………………………………………5 1.4 材料与方法……………………………………………………8 1.5 结果……………………………………………………………21 1.6 讨论……………………………………………………………36 1.7 结论……………………………………………………………42 1.8 参考文献………………………………………………………43 1.9 英汉缩略词对照表……………………………………………46 2 致谢……………………………………………………………47 肝纤维化的基因治疗 （综述）………………………………48 3 CTGF 和TIMP-1 shRNA 对肝纤维化大鼠的影响 摘 要 目的：研究CTGF 和TIMP-1 短发夹RNA （short hairpin RNA，shRNA ） 表达质粒重组体对肝纤维化大鼠肝脏组织 CTGF 、TIMP-1 、Col-I 及 Col-IIImRNA 基因表达及CTGF、TIMP-1、Col- Ⅰ及Col- III 蛋白表达情况 的影响，探索抗肝纤维化的机制，为肝纤维化的基因治疗探索新思路。方 法：50 只清洁级Wistar 雄性大鼠被随机分为A 组：双重RNA 干扰组；B 组：CTGF 干扰组；C 组： TIMP-1 干扰组；D 组：空载质粒治疗对照组； E 组：模型对照组。每组大鼠腹腔注射1％DMN 溶液，每次注射80μl ／100g， 每周连续注射3 次，共3 周。从第3 周末开始尾静脉高压注射质粒干扰： A 组注射 psiRNA-GFP-Com （含有 CTGF 和 TIMP-1) ，B 组注射 psiRNA-GFP-CTGF，C 组：注射psiRNA-GFP-TIMP-1，D 组注射空载质粒 psiRNA-DUO-GFPzeo，E 组：不注射。每2 周注射1 次，共4 次。所有大 鼠于实验第12 周末处死，收集肝组织备用。各组肝脏组织中性甲醛固定后 HE 染色检测肝组织病理形态学改变，免疫组织化学检测各组肝组织中 CTGF、TIMP-1、Col- I 及Col- III 蛋白表达情况。抽提各组肝脏组织RNA 并逆转录成cDNA 通过荧光定量PCR 检测各组肝脏组织的CTGF mRNA 、 TIMP-1 mRNA 、Col- I mRNA 及Col- III mRNA 的表达情况。结果：与模 型对照组 （E 组）相比，空载质粒治疗组 （D 组）CTGF、TIMP-1、Col- I 及Col- III mRNA 及肝脏组织中的CTGF、TIMP-1、Col- I 及Col- III 蛋白 的表达均无差异，A 组、B 组、C 组CTGF、TIMP-1、Col- I 及Col- III mRNA 的表达降低，肝脏组织中CTGF、TIMP-1、Col- I 及Col- III 蛋白的含量减 少，其中双重RNA 干扰组psiRNA-GFP –Com 质粒转染 （A 组）肝纤维化 大鼠后其对Col- I mRNA 的表达及肝组织中I 型胶原的蛋白含量的抑制程 度优于单干扰组质粒转染 （P＜0.01 或P＜0.05 ）。结论：1. 针对CTGF 和/ 或TIMP-1 的RNA 干扰可明显抑制肝纤维化大鼠的CTGF、TIMP-1、Col- I 及Col- III 基因表达及相关蛋白的分泌。2. 双重联合RNA 干扰作为抗肝 纤维化基因治疗的方法，其治疗效果可能会优于单个RNA 干扰。 关键词：RNA 干扰；结缔组织生长因子；基质金属蛋白酶组织抑制因 子-1；短发夹RNA ；转染；肝纤维化；大鼠；尾静脉高压注射；N-二甲基 亚硝胺 Effect of CTGF shRNA and TIMP-1 shRNA on r