中国特有小型猪源性反转录病毒的检测与特性分析.pdfVIP

博士论文 中文摘要 中国特有小型猪内源性反转录病毒的检测与特性分析 摘 要 由于人源供体器官的短缺，人们希望借助异种移植来获得大量的组织／器官 移植物，猪被选定为最合适的异种移植供体。然而，猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous 对异种移植病原安全性的广泛关注，即带有PERV的猪细胞／组织／器官一旦植入处 于高度免疫抑制的病人体内，是否可能突破种间屏障造成人源大流行?国际上要 求对人类异种移植建立远期评估的呼声越来越高，有关PERV生物学特性的研究 及对PERV的病原安全性进行评价成为一个新的热点。 我国丰富的小型猪种资源有望为猪一人异种移植提供优良供体，目前已经开 展异种移植的相关研究，人用转基因猪皮肤已经进入产业化阶段，但对PERV的 研究尚未引起充分的重视。为了开发利用我国小型猪种资源，为异种器官移植受 体提供安全可靠的供体器官，我们在前期研究的基础上，有必要深入开展PERV 相关研究。一方面进一步了解我国小型猪种群中PERV的存在状况，为筛选PERV 低拷贝猪奠定基础；另一方面研究我国小型猪内源性释放毒株的生物学特性，并 探索嗜人性PERV感染人源细胞后产生的分子效应，为揭示PERV的潜在病理作用 及进行异种移植的病原安全性评价打下基础。为此本研究主要进行了以下工作： (1)中国特有小型猪内源性反转录病毒拷贝数的检测 设计并合成了检测PERV pol基因的引物，运用实时荧光定量PCR方法对中国 特有小型猪基因组中整合的PERV拷贝数进行了系统检测，结果表明，五指山猪 与巴马小型猪基因组中均可检测到pol基因的存在，五指山猪单细胞基因组中 单细胞基因组中PERV的拷贝数具有显著性差异，五指山猪基因组中整合的PERV 拷贝数较低。 五指山猪基因组中PERV的基因序列负荷较低，因此有希望通过选择性育种 获得PERV低拷贝猪，在此基础上则易于进一步筛选出无完整PERV前病毒的小型 猪个体，也易于通过基因敲除去除PERV，从而为异种移植提供合适供体。此外， 基于SYBRGreen I的PERV拷贝数的定量PCR检测方法，与SouthernBlot检测拷贝 数的方法相比具有明显的优越性，简便易行，可在短时间内检测大量样品，费用 低廉，利于对猪群进行大规模筛选，既可用于实验用猪的病原安全性评价，也可 用于异种移植后PERV存在与表达状况的监测。 博士论文 中文摘要 (2)五指山猪内源性反转录病毒前病毒全基因克隆与序列分析 应用PCR技术将五指山猪内源性反转录病毒前病毒全基因分为两段进行扩 增，然后构建前病毒全基因克隆，运用生物信息学方法对其序列进行分析，并与 析，构建了基于Ellv氨基酸序列的进化树。结果表明，五指山猪来源的PERV前 相似但仍具有一定的差异性。进化分析结果表明PERV-WZSP与其他A亚型毒株 属于同一分支，这与PCR分型鉴定的结果也相一致。此外，我们还发现该株PERV 胞中复制能力的增强；3’LTR中含有PERV-C亚型中的特异性序列，这将可能导 的研究来对这种推测进行验证。 本研究有助于深入了解五指山猪内源性反转录病毒的分子生物学特性，并为 下一步构建PERV感染性克隆奠定了良好基础。 ’ (3)嗜人性PERV感染人源细胞模型的构建与鉴定 为了研究嗜人性PERV感染人源细胞后的分子效应并探索其可能的病理作 用，我们首先构建并筛选具有较高反转录酶活性的PERV细胞感染模型。采用细 立五指山猪来源PERV的体外细胞感染模型。共培养后的HEK293细胞在形态、生 长特性及折光性上与阴性对照HEK293细胞没有明显差异。 锄v的mR_NA的表达，采用Western Blot方法鉴定Gag蛋白的表达，进一步采用反 转录酶活性检测实验筛选具有较高反转录酶活性的嗜人性PERV的人源细胞，结 果表明共培养后第49天左右时反转录酶活性较高，于是提取此时的细胞总蛋白， 用于下一步蛋白质组学分析。