新型丙型肝炎病亚基因复制子及稳定细胞系的构建.pdfVIP

中 文 摘 要 新型丙型肝炎病毒亚基因复制子及稳定细胞系的构建 摘 要 丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV ）感染率占全世界人口的 1%-2%，约占我国人口的 3.2%，是急慢性肝病的主要致病因素之一，约 70%-80%的感染者转为慢性，其转归和肝硬化及肝细胞癌有密切关系[1] ， 在美国，HCV 感染已经成为重症肝病晚期进行肝移植的最主要原因。由 于其高流行性、病程的隐匿性和长期感染导致预后不良，丙型病毒性肝炎 成为一个严重的医学和社会经济学问题[2] 。HCV 是黄病毒科、丙型肝炎 病毒属的唯一成员，在 1989 年就被鉴定出来，并且引起了对 HCV 基因 结构、病毒蛋白结构和生化特征研究的热潮。但由于HCV 基因组有显著 的序列变异，尤其是在E2 包膜蛋白编码区的高变区，在全球范围内HCV 的基因型多达30 个，另一方面 HCV 在体外自主复制水平极低，且其唯 一的可感染动物为黑猩猩，故缺少有效的细胞培养系统和经济的小动物模 型来研究HCV 复制及其致病机制，严重阻碍了对HCV 生命周期和筛选 抗病毒药物的研究。为克服这一困难，研究者们进行了大量的实验探索， 直到 1999 年才有了突破性的进展：建立了一个有效的细胞培养模型 —HCV 复制子系统( HCV Replicon System)[3] 。这个系统的基础是利用基 因工程构建的亚基因组HCV RNA 转染人肝癌细胞系Huh-7 细胞，且可在 此细胞中自主复制。 内源性核糖体结合位点（Internal Ribosome Entry Site, IRES ）是具有 高级结构RNA 片段，负责细胞性蛋白翻译结构的形成和病毒蛋白产物的 合成。虽然病毒mRNA 的IRES 结构精密且有数百个核苷酸组成，但是有 一系列的证据表明小片段的核苷酸序列，无论是自然形成还是人工合成， 都能够发挥起始翻译的功能。Chappell 等报道，分析RNA 结合域蛋白3 [4] （Rbm3 ）的结构 ，发现一个仅22nt 的小区段能够发挥更为强大的IRES 功能，比目前常用的EMCV IRES 强10 倍。利用这个小IRES ，可以减少 mRNA 的长度，如何用在HCV 复制子的构建，将减少插入序列的长度， 从而能够构建一个高效表达 HCV RNA 并能够表达抗性基因和报告基因 的新型HCV 亚基因复制子。 1 中 文 摘 要 报告基因(Reporter Gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因， 也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。可通过IRES 或与 其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产 物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。诸如海肾荧光素酶报告 基因（Renilla Luciferase Reporter Gene ）[5] 、萤火虫荧光素酶报告基因 （Firefly Luciferase Reporter Gene ）、β- 内酰胺酶报告基因（Beta Lactamase Reporter Gene ）、和反式诱导产生的分泌性碱性磷酸酶报告基因（Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Gene ）已经被广泛应用于检测HCV 复制子 RNA 的复制与表达情况。其中荧光素酶报告基因系统是最常用、最精确 地一种。荧光素酶活性和复制子RNA 复制水平直接相关，说明其是一个 稳定的复制标记。通过测定复制子荧光素酶活性就可以在转染后各个时间 点检测复制子 RNA 的复制情况。将荧光素酶置于脑心肌炎病毒 （Encephalomyocarditis Virus, EMCV ） IRES 翻译后的调控比HCV IRES 的调控能够更好的增强复制水平、报告基因活性和其他许多可重复再现的 结果。 丙型肝炎复制子的基本结构包含: (1)带有HCV 5 ’-NTR 和部分编码 核心蛋白区域(核苷酸342 到377/389