cbl-b srna稳定转染的mgc803细胞系的构建.pdf

目 录 一、 摘要 中文论著摘要……………………………………………………l 英文论著摘要……………………………………………………4 二、英文缩略语……………………………………………………7 三、论文主体 前言．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．……···················…······…···“·”·”·8 丹IJ舌“一”一一“”“”“……一”“一”“一“”一…………………～o 材料和方法………………………………………………1O 结果……………………………………………………………12 讨论……………………………………………………………16 结论……………………………………………………………18 四、本研究创新性的自我评价………………………………………19 五、参考文献………?……………………：…………………………‘20 六、附录 综j苤……………………………………·…··……………………23 在学期间科研成绩………………………………………………31 致谢……………………………………………………．．．．．．……32 个人简介…………………………………………………………33 ·中文论著摘要· Cbl—b 目 的 构建靶向Cbl．b基因的短发夹环RNA(shRNA)真核质粒表达载体，并转染至 MGC803胃癌细胞中，用G418进行筛选，建立Cbl-bshRNA稳定转染的MGC803 细胞株，并进行检测。利用这种稳定转染的胃癌MGC803细胞系，进行Cbl．b调 节EGFR信号转导通路的相关研究。 方法 1、引物设计 根据Cbl—b基因序列，通过软件设计三个靶序列，利用BLAST进行同源性分析， 设计出2组Cbl．bshRNA序列及1组对照靶序列。shRNA舾lJll顶序均为：BamHI酶 I酶切位点+正义序列 切位点+反义序列+loop+．t正义序列+TC+HindKI和BamH +100p+反义序YlJ+AG+Hindlll。 2、构建Cbl．bShRNA质粒 后，以T4连接酶连接于同样经过采用Barn．HI／HindIII限制性内切酶进行酶切后的 pRNA-U6．1／Neo载体内。将构建成的表达质粒转化至感受态菌DH50【中，将菌液涂 布于含有氨苄青霉素的LB平板，筛选阳性菌落。 3、测序 对构建完毕的质粒进行测序，通过检测结果可以看出三段引物均成功插入质 粒内。测序确认后进行大量复制、扩增，提取重组质粒。 4、基因转染 用含10％新生小牛血清的DMEM培养基培养MGC803胃癌细胞。将对数生长期 的细胞于转染前24d,时，按每孔lXl04个细胞密度接种于6孔培养板，当细胞达85 2000说明书进行重组质粒转染。转染后48d,时，换 q5％时按照，Lipofectamine 为G418培养液，培养2周后，显微镜观察后，挑选克隆。 5、Western Blot坳JJ转染后细胞中Cbl-b的表达 收集转染后细胞进行裂解，提取细胞蛋白，取20pg处理后的蛋白样品进行 然后二抗孵育30min，TBST洗膜后加入ECL发光液，孵育5min，暗室中用X片曝光， 显影，定影。以未转染细胞系和转染对照质粒的细胞系作为对照，选取表达率为 对照组10％以下的细胞株为阳性细胞株。 6、MTT法检测四种胃癌细胞的增殖 取对数期生长的未转染胃癌MGC803细胞，转染后的空白对照，Cbl—b基因沉 默胃癌MGC803细胞，进行胰蛋白酶消化，消化后用培养液制成单细胞悬液，调 整细胞浓度至3x 72h后，加入MTT，于相同培养条件下继续培养4h。加入DMSO，在恒温振荡器 组的oD值。 7、Western B10t检测沉