人巨细胞病毒u135基因编码蛋白的生物学功能研究.pdf

目 录 一、摘要 中文论著摘要……………………………………………………………………··l 英文论著摘要………………………矗…………………………………………·3 二、英文缩略语………………………………………………………………………·6 三、论文 前言…………………………………………………………………………………………………………·7日U舌…………………………………………………………………………………………………………’7 材料与方法………………………………………………………………………“9 结果………………………………………………………………………………………………………一18 讨论………………………………………………………………………………………………………··23 结论………………………………………………………………………………………………………一25 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………26 五、参考文献…………………………………………………………………………27 六、附录 综j苤………………………………………………………………………………………………………·28 在学期间科研成绩………………………………………………………………37 致{射………………………………………………………………………………………………………”38 个人简介…………………………………………………………………………39 ·中文论著摘要· 人巨细胞病毒ULl35基因编码蛋白的生物学功能研究 目 的 人巨细胞病毒(human HCMV感染可引起患儿的神经系统及消化系统的多种疾病，己成为引起新生儿疾 病和先天畸形的重要感染因素之一，但HCMV先天感染的致病机制尚不清楚。 1996年，Cha 的低传代分离株进行了核酸序列比较，发现Toledo株在UL／b’区含有19个在 ADl69株不存在的新基因，分别命名为HCMV 此19个基因可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面起重要作用。本研究 以酵母双杂交系统为手段筛选与HCMVULl35蛋白相互作用人胎脑文库的蛋白 因子，进而找出HCMV感染导致神经系统疾病的可能途径。该研究以这一区域片 段作为诱饵蛋白，从人胎脑细胞文库中筛选与之结合的靶蛋白，为进一步深入研 究HCMV的致病机制奠定基础。 实验材料与方法 一、实验材料 标本为中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代分离株H；构建 表达载体的相关试剂；酵母双杂交实验相关试剂；常用实验设备如BECKMAN台 Elmer 式低温高速离心机、Perkin PCR循环仪、电穿孔仪(BioRad)、全温振荡 培养箱等；常用数据库及分析软件如基因组数据库、蛋白质分析数据库、凝胶成 像及扫描分析软件、引物设计软件等。 二、实验方法 从感染了人巨细胞病毒的人胚肺中提取HCMVDNA，应用PCR技术以 HCMV 分析。 应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与HCMVULl35编码蛋白相互 作用的蛋白。1、提取文库质粒；2、将含有pGBKT7．ULl35重组质粒转化到酵母 母细胞AHl09中；3、筛选阳性克隆(显色反应及PCR技术)，回转鉴定，将与 HCMV．ULl35相互作用的eDNA文库基因测序；4、BLAST分析。 硅 毋 耋日 术 采用特异性引物扩增出HCMV ULl35基因片段，片段长度为987bp，并成功 将HCMV ULl35片段克隆到酵母系统的转录结合域pGBKT7上，命名为 I和BamH I限制性内切酶进行酶切鉴定，测序 取pGBKT7．ULl35质粒，用EcoR 分析显示结果与预期一致。 行了测定，在二缺平板上长出260个克隆，计算转化效率=0．26X