双突变视紫红质白(rho-r135gg188r)转基因斑马鱼视网膜色素变性模型的建立.pdfVIP

中文摘要 网膜色素变性(retinitispigmentosa，RP)模型，并检验该突变所致视网膜变性的特征。 方法： R135G／G188R通过显微注射的方法导入野生型斑马鱼胚胎，制造出两种暂时性转基 因斑马鱼(Fo代)，分别表达外源性的野生型斑马鱼视紫红质或其双突变体 (EGFP)阳性的Fo代转基因幼鱼。并用荧光和／或免疫荧光冰冻切片分析技术检测转 基因视紫红质的水平和其在视网膜上的分布，以及视网膜变性的表现。 结果： 在本试验中，1．3．kb的爪蟾视紫红质启动子(Xenopusrhodopsinpromoter, XOP)片段足以替代全长5．5．kb的XOP启动转基因构造表达。通过常规荧光显微镜下 观察完整活体斑马鱼幼鱼眼睛荧光表达情况以及图像采集，可鉴别出成功的转基因 个体：三次显微注射试验总计约1000枚胚胎中，平均约5％-7％的幼鱼呈EGFP阳性。 冰冻切片分析显示，鱼卵受精后第5天(5dayspostfertilization，5d明 平却明显升高；结合EGFP在视网膜上的分布位置分析，可能是转入的双突变视紫 红质的表达导致了视杆细胞特异性的视网膜变性，考虑到对照外源性转基因视紫红 质没有引起此现象，提示视杆细胞死亡是呈R135G／G188R突变特异性的。