利用CRISPR_Cas9技术构建定点突变小鼠品系.pdfVIP

Hereditas (Beijing) 2015 年 10 月, 37(10): 1029―1035 研究报告 利用CRISPR/Cas9 技术构建定点突变小鼠品系 1,2 2 3 2 3 2 白敏 ，李崎 ，邵艳姣 ，黄元华 ，李大力 ，马燕琳 1. 贵阳中医学院研究生院，贵阳 550002 ； 2. 海南医学院附属医院，海南省人类生殖与遗传重点实验室，海口 570102 ； 3. 华东师范大学生命科学学院，上海 200241 摘要:CRISPR/Cas9 技术是新近发展起来的对细胞和动物模型进行基因编辑的重要方法。本文利用DNA 双链 断裂(Double-strand breaks, DSBs) 引起的同源重组(Homologous recombination, HR)依赖与非依赖的修复机制，建 立基于 CRISPR/Cas9 核酸酶技术构建定点突变小鼠品系的技术体系。针对赖氨酸特异脱甲基化酶 2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活关键位点对应的基因组DNA 序列设计单一导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA) ，通过与Cas9 mRNA 共显微注射，分别得到Kdm2b 基因发生移码突变的基因失活品系及关键位点氨 基酸缺失的酶活突变型小鼠品系。此外，利用 HR 介导的修复机理，将黄素单加氧酶 3(Flavin containing mo- nooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA 序列及对应的点突变单链寡脱氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN) 修复模板共注射到小鼠受精卵雄原核。对F0 小鼠基因测序分析显示，成功构建了Fmo3 基因移码突变的基因敲 除和单碱基定点突变的基因敲入小鼠，这些突变能够稳定遗传给子代。本研究利用CRISPR/Cas9 技术，通过同 源重组依赖与非依赖两种DNA 损伤修复方式，成功构建了特定位点突变的小鼠品系。 关键词:基因敲除；基因敲入；酶活突变；同源重组 Generation of site-specific mutant mice using the CRISPR/Cas9 system 1,2 2 3 2 3 2 Min Bai , Qi Li , Yanjiao Shao , Yuanhua Huang , Dali Li , Yanlin Ma 1. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 2. Hainan Provincial Key Laboratory for Human Reproductive Medicine and Genetic Research, Hainan Reproductive Medical Center, the Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, China; 3. Shanghai Key Laboratory of Regulatory Biology, Institute of Biomedical Sciences and School of Life Sciences, East China Nor- mal University, Shanghai 200241, China Abstract: The CRISPR/Cas9 system is a recently developed important technology for genome editing in cellular and animal models. Here we established a CRISPR/Cas9-based system of generating site-specific muta