DNA的基本分子生物学操作资料.pptVIP

DNA的基本分子生物学操作（表达载体的构建） 胥慧 2009.9 如何研究某个基因的功能? 遗传学 突变体 基因缺失或下调 过量表达 体内/体外生化反应 表达载体的构建 表达载体构建流程 零、策略的设计 一、PCR扩增基因 二、乙醇沉淀基因 三、酶切基因及载体 四、琼脂糖凝胶电泳回收基因及载体 五、连接 六、转化大肠杆菌 七、质粒的小量提取 八、PCR/酶切鉴定及测序 九、质粒的大量提取 查找基因 设计引物 引物长度：18-22 nt GC含量 （DNAMAN hybrid: 50~60℃） DNAMAN检查：游离3’端 8 bp 以G/C结尾 酶切位点的选择 （巧用平端酶） 保护碱基 负义链引物注意反向 考察是否移码 一、PCR（Phusion / Taq） 5 X HF buffer: 10 μl NEB dNTPs: 0.5 μl Phusion: 0.4 μl Primer 1: 0.5 μl Primer 2: 0.5 μl Template: 1 μl ddH2O: 37.1 μl 98℃ 1 min 98℃ 1