α-干扰素抗小肝纤维化相关免疫机制研究.pdf

中文论著摘要· Q．干扰素抗小鼠肝纤维化相关免疫机制研究 ．●上 刖 罱 肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿性反应，也是向 肝硬化发展的主要中间环节，肝纤维化最终可发展为肝硬化甚至肝癌。肝纤维化 有逆转的可能性，因此，在此阶段的有效治疗无疑是肝硬化甚至肝癌防治工作的 重中之重。 织细胞产生并分泌的一类具有多种生物活性的糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和免 疫调节作用。目前，临床上已用于治疗肝纤维化，但具体抗纤维化机制尚不明确。 四氯化碳(CCl4)致使小鼠肝纤维化为探讨IFN．a抗小鼠肝纤维化免疫应答机 制提供了一个宝贵的实验动物模型。在肝纤维化发生、发展过程中，多种免疫细 胞通过合成分泌不同的细胞因子、趋化因子等化学介质介导免疫炎症反应。在各 种因素导致的炎症反应急性阶段，受损肝细胞、内皮细胞及被激活的肝星状细胞 stellate (hepaticcells，HSC)可分泌多种细胞因子和趋化因子，趋化肝组织及血循环 中的天然免疫细胞(单核巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞)及获得性免疫细胞(T细 胞和B细胞)浸润损伤部位，介导急性期的免疫炎症反应及损伤组织的修复反应； 在慢性炎症阶段，炎症反应和组织修复循环交替、HSC持续激活、细胞外基质 (extraceilularmatrix，ECM)合成与分解代谢失衡，过度沉积于肝脏，导致肝纤维化。 细胞因子、趋化因子与免疫细胞共同构成影响肝星状细胞的免疫微环境。用药物 总体调节肝脏的免疫微环境，诱导免疫细胞向逆转肝纤维化的功能方向发展，可 能成为治疗肝纤维化的一种新思路，对阐明肝纤维化发病机制及探索肝纤维化治 疗靶点具有重要意义。 我们利用成功建立的小鼠肝纤维化模型，分析了参与肝纤维化发生、发展及 结局的免疫应答调控的相关因素，动态观察IFN．旺不同剂量组在不同治疗周期对小 鼠肝纤维化结局的影响、肝(局部)脾(全身)免疫效应细胞及产生细胞因子的 变化，以期为肝纤维化的治疗提供新的靶点。 实验方法 l、实验动物及主要试剂 6～8周龄、雌性BALB／ctJ、鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证 榄油：山东鲁花集团产品；注射用重组人IFN—a2b：购自美国先灵葆雅，批号： 型SP超敏试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司；流式单克隆抗体：购自 美国BD公司及eBioscience公司。 2、动物模型制作、分组及相应处理 次／周，共8周(前两次剂量减半)。 (2)分组及治疗：将肝纤维化小鼠分为A组(生理盐水组)、B组(IFN-a 低剂量组)、C组(IFN吨中剂量组)、D组(IFN．a高剂量组)，分别给予治疗。 另设正常对照组E组。注：A组：O．9％注射用水；B组：IFN．a 400U／只，1001．d： C组：IFN．Q 800U／只，1001xl；D组：IFN．-a1200U／只，1001xl。隔日皮下注射， 现用现配(前三次剂量减半)。 3、病理切片制作 小，立即放入10％甲醛溶液中固定保存，备检。切片做病理HE染色和MASSON 染色。 4、脾细胞培养 a．干扰素治疗小鼠三周、六周和八周常规无菌取出脾脏，用10ml含5％热灭 2 室温离心10min，收集上清，．80℃保存，待细胞因子测定。 5、流式细胞仪检测小鼠肝脏及脾脏细胞 6、细胞因子检测 计算细胞因子含量(pg／m1)。 7、统计学分析 实验数据用SPSSl7．0统计软件处理，对各个实验组数据进行单因素方差分析 (One-WayANOVA分析)及多重比较(Dunnett．t检验)，P0．05有统计学差异。 实验结果 1、IFN—Q对肝纤维化小鼠肝组织病理的影响 造模成功与否判断：造模6周及8周后分别取2只鼠，取肝脏做病理HE染色验 证其肝纤维化模型是否成功。汇管区周围纤维化明显．有芒状纤维和纤维间隔形 成。中度肝纤维化形成即可。(纤维隔形成并互相连接深入小叶内，小叶结构保留 或紊乱，但无肝硬化。) 与生理盐水