中间锦鸡儿油酸氢酶基因（cafad2）克隆与功能鉴定.pdf

摘要 木本植物油脂资源丰富，是制造生物柴油的重要原料。提高单不饱和脂肪酸含 量，是改善植物油脂品质，改良油脂植物，降低生物柴油成本的关键。同时，脂肪 酸也是植物细胞膜组成的重要部分，对于维持植物正常的生长发育和抗逆能力至关 重要。利用基因工程手段改变油脂植物的脂肪酸成分，提高木本油料植物单不饱和 脂肪酸比例，是刨制抗逆性强的优质生物柴油原料植物的重要途径。油酸脱氢酶(油 酰磷脂酰胆碱去饱和酶，FAD2)催化油酸脱氢合成亚油酸，调控多不饱和脂肪酸 合成，是植物脂肪酸代谢过程中的关键元素。因此研究该酶基因的结构与功能，揭 示其调控脂肪酸代谢的机理，探索表达调控方式和时空变化具有重要的理论和实际 意义，但是，迄今有关木本油料植物脂肪酸合成分子生物学研究较少。本研究应用 intermedia)中克隆获 分子生物学手段，从木本油料植物一中间锦鸡儿(Caragana 能，成功构建了该基因的反义表达和正义表达载体，利用根癌农杆菌介导法成功获 得脂肪酸不饱和度明显改变的转基因烟草株系，结合表型、生理生化和分子生物学 对转基因烟草株系进行了综合分析，验证分析了CaFAD2基因的功能。 传改良提供了试验和技术基础。 基酸。所编码的蛋白质与大豆、芝麻、莲的FAD2同源性均达到80％以上；与拟 南芥、烟草、油菜的同源性高于70％，属于油酸脱氢酶类。推测该蛋白质酶具 有脂肪酸去饱和酶的6个跨膜区域和3个组氨酸保守区域。 3、定量PCR检测结果表明，CaFAD2基因在中间锦鸡儿茎和叶中都有表达，但在 不同器官中表达模式不同，叶中表达量高于茎中。 4、利用CaFAD2基因保守区域片段构建成功Ca尉D2基因反义表达载体。通过根 癌农杆菌系统导入烟草，筛选获得CaFAD2基因抑制程度不同的阳性转基因烟 草株系RTC0系。与对照烟草相比，转CaFAD2基因烟草叶片和种子总脂中多不 饱和脂肪酸含量分别降低约20％和10％，而油酸含量分别升高约16％和7％，说 明CaFAD2基因在烟草能够反义表达，抑制烟草内源FAD2基因表达。 5、成功构建了CaFAD2基因全长正义表达载体，并利用根癌农杆菌表达系统转化 烟草，获得阳性转∞尉D2全长基因的烟草株系TC0系。开展了转基因烟草和 对照烟草低温过冬(8-12℃)培养试验，结果发现，对照烟草存活率(20％)明 显低于转基因烟草TC0系(90％)。 达，提高烟草中用D2基因表达量，促进了多不饱和脂肪酸合成，转基因阳性烟 草种子和叶片中多不饱和脂肪酸分别增加了7．77％和10．96％。 基因结构和功能差异。两个基因均来自茎叶，编码的蛋白质氮基酸同源性达 90％，具有3个组氨酸保守区和6个跨膜区，但是前者氨基酸比后者少33个， 组氨酸和跨膜区位置也有所不同。转基因研究发现，CaFAD2基因和SoyFAD2 基因在烟草中均能正义表达，促使烟草种子和叶片中多不饱和脂肪酸含量增加， 基因结构和表达调控机制复杂，可能存在转录和转录后综合调控机制。本研究 结果为进一步研究脂肪酸合成酶基因表达规律和开展木本油料植物转基因改良 提供了试验技术基础。 关键词：生物柴油，中间锦鸡儿，FAD2，基因功能鉴定 ABSTRACT an As renewable fastinrecent energy,Biodiesel important develops years、vitllhi曲 of oilandlow oflow price，lacking quality．Because plant combustingvalue，hi曲 and of its tocultivateoil instability