不同月龄胎儿脐和不同培养方法对分离人脐带间充质干细胞的影响.pdfVIP

中文摘要 不同月龄胎儿脐带和不同培养方法对分离人脐 带间充质干细胞的影响 摘 要 目的：人脐带来源的问充质干细胞作为一种新的种子细 胞来源越来越受到人们的重视。先前的研究表明从人脐带组 织中分离的间充质干细胞既具有增殖能力，又具有向多细胞 (神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞 等)分化的能力u以1，加之来源广泛、取材容易，在细胞移 植、基因治疗、组织工程中有广阔的应用前景。然而，我们 在过去四年的研究中体会到从人脐带分离间充质干细胞并 非易事，特别是如何快速、高效的从脐带中获得MSC以满 足基础和未来临床研究的需要是一个亟待解决的问题。为 此，本课题对不同胎龄胎儿脐带和不同培养方法对分离人脐 带间充质干细胞的影响进行了研究。 方法： 1人脐带间充质干细胞培养：(1)组织贴块法：分别取足 月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带35例及流产胎儿脐带33例，以 PBS充分冲洗，剔除脐带动、静脉，将其余的脐带间质组织 切割成直径约lmm大小的组织块，在含有20％的胎牛血清、 素的低糖型培养基(H6．DIEM)中培养，原代培养3—7天后， 显微镜下可见大量细胞自组织块中游出，向外呈放射状贴壁 中文摘要 生长。待细胞达到80％-90％：}E合后，加入0．2％胰酶消化传 代。收集MSCs脐带间充质干细胞后冻存待用。(2)胶原酶．胰 酶消化法：分别取足月妊娠剖富产健康胎儿的脐带17例及流 产胎儿脐带15例，超净台内取出脐带PBS充分洗涤，冲去脐 静脉及动脉内的残存血，将脐带剪碎至1ram3大小组织块， 移至0．1％胶原酶Ⅳ中，37℃持续搅拌消化30rain；随即向胶 原酶．组织块消化体系内加入终浓度为0．1％的胰酶在37℃环 min；10％FBS终止消化，用细胞筛过 境中继续搅拌消化30 滤，将含细胞的滤液进行离心。细胞接种子LG．DMEM培养 基的T-25塑料培养瓶中。3，4d后，更换培养基，去掉未贴 壁细胞。以后每3天换液1次，至细胞融合传代。 2将贴壁的干细胞消化。加入O．2％胰酶／o．2％EDTA，待 细胞大部分变成圆形后，加入含有10％FBS的DMEM中止消 化，吹打贴壁细胞使贴壁细胞变成悬浮状态。1000rpm离心 10分钟，弃上清液，PBS洗涤(去除剩余的血清等)。室温下， 细胞计数。安每管3—4×105分成12管各管中加入下述PE、 清液，加入2MLPBS 1000rpm离心两次，各5分钟。调整最终 容积为200ML，上机进行流式细胞检测。同时以小鼠FITC、 PE—CD38、PE．CD44、PERCP．CD45、APC-CD90、 结果： 中文摘要 1组织块原代培养：足月龄脐带组约1周左右，可见细胞自 组织块游出，贴壁呈放射状生长，形态较均一，呈长梭形。 经10天左右达N80％一90％汇合，镜下可见细胞胞浆丰富， 轴突伸长，多角状。消化后以1：2一l：3的比例传代细胞， 接种约30分钟后细胞开始贴壁，6—8小时贴壁完全，传代后 经换液3—5天完全汇合时镜下可见细胞排列紧密，无序生 长，小月龄脐带组约4，5天左右可见细胞游出；经5天左右达 到80％一90％汇合，细胞传代增殖特点与足月组相似。第2 天即看见有少量形态各异的贴壁细胞，散在分布。 2胶原酶．胰酶消化法：第2天即看见有少量形态各异的贴壁 细胞，散在分布长梭形细胞间可见少量鹅卵石样细胞组成的 集落，考虑为脐静脉内皮细胞。长梭形细胞即为MSC细胞，其 形态类似于成纤维细胞，增殖能力旺盛，约1周左右时，贴壁 细胞形成集落，占优势的是成纤维样细胞，此外还有脐静脉内 皮细胞，至2周左右可达N80％融合，脐静脉内皮细胞生长则受 到明显抑制。2．59／L胰酶消化，传代后可得到较纯化的成纤维 样细胞。 3流式细胞学检测结果显示：对小月龄胎儿脐带培养的间充 质干细胞进行免疫表型分析表明：CDl3、CD29、CD44、 表达间充质细胞特异性抗原标志而不表达造血干细胞、内皮 细胞特异性标志。这和足月胎儿脐带流式检测结果一致。并 与骨髓、脐血、胎肺等其他组织来源的MSCs流式检测结果 也一致。 说明细胞成分比较均一。