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郑州大学2007年硕士研究生论文TGF-B2反义寡核苷酸对兔角膜损伤修复的影响 TGF．B。反义寡核苷酸 对兔角膜损伤修复的影响 硕士研究生 连元君 导 师 郑广瑛 郑州大学第一附属医院眼科 河南 郑州450052 中文摘要 目的及意义 眼外伤在临床上极为常见。角膜由于其解剖和生理特点，位于眼球的最前端， 暴露于睑裂之中，且为一透明而规则的屈光界面，因而，极易遭受各类外伤的侵 袭。角膜创伤愈合后，常遗留瘢痕而形成角膜散光，影响视功能的恢复和美观。 角膜创伤的修复是一系列的动态级联过程，通常包括角膜基质细胞，即成纤 维细胞的激活、增生、分化、细胞因子的释放、细胞外基质的合成和重建等，此 过程是由多种细胞和细胞因子在时间和空间上高度协调而完成的。越来越多的研 growthfactor-口，TGF-B)在机体伤口 究表明转化生长因子--beta(Transforming 愈合过程中起到重要的调节作用，其中TGF-B：是角膜创伤修复的启动因子，通 过调控TGF—B。的活性可调控角膜创伤的修复过程。本实验采用实验动物兔制作 antiserise 角膜穿孔伤模型，设计应用TGF—B。的反义寡核苷酸(TGF．B2 ASON)转染角膜外伤缝合术后的瘢痕组织，然后通过裂 oligonuclcotide，TGF．B2 隙灯观察、脏染色、免疫组化和荧光定量PCR等检测手段从大体形态、组织结 构、细胞蛋白数量及基因水平等不同层面观察分析TGp鼻2反义寡核营酸对 TGF-B2的活性的影响，为实现药物干预减少瘢痕形成以控制外伤性角膜散光的 设想提供理论依据。 郑州大学2007年硕士研究生论文TGF-62反义寡核苷酸对兔角膜损伤修复的影响 材料与方法： (1)TGFoB2反义寡核苷酸(anti—SeBSe 根据兔TGF-B2mRNA序列(Genebank号AY429466)，由上海生工生物技术 有限公司合成一段21bp 的 ASON，其序列为 5’． AGAA MSON)作为对照， 其序列为 oligodeoxynucleotide， 5’．GCGAr《了rGGCArD姐ACCC兀：3’。 (2)选用清洁级健康无眼病的新西兰大白兔24只，雌雄兼用，月龄为3个月。 随机分组：实验组16只，双眼均制备角膜穿孔伤缝合术后模型。左眼术后 组8只，不做手术，同样左眼滴TGF-B2ASON，右眼滴生理盐水。 标本制作：两组分别于手术后4、7、14、28天取角膜标本，每次6只兔子 (实验组4只，对照组2只)；角膜的三分之一石蜡包埋，三分之800c冰箱 中保存。 (3)裂隙灯观察 HE染色 免疫组化 RealtimePCR检测 结果：- ASON组：球结膜轻度充血，角膜缝线附近水肿，前 (1)裂隙灯观察：TGF—B2 房闪辉(0～+)，虹膜纹理清晰，瞳孔圆居中，眼压均正常。随着时间的延长， 眼前段炎症反应逐渐减轻，至术后1周完全消失。生理盐水组：角膜明显水肿， 前房闪辉(+～++)，虹膜纹理不清晰，瞳孔欠圆，眼压均正常，角膜缘同时期 出现大量新生血管。随着时间的延长，眼前段炎症逐渐减轻，至术后2周完全 消失，但角膜缘新生血管未消退。 (2)HE染色组织病理学观察： TGF-IB2ASON组：术后4d上皮细胞生长1～2层，基质层成纤维细胞体积 增大，扁平，数量增多，平均每个高倍镜下9个染色细胞；术后7d，上皮增生4～ 5层，排列不规则，基质层成纤维细胞数目增多，平均每个高倍镜下12个染色 Ⅱ 塑塑盔兰!!堕至堡主婴塞竺笙塞!鱼些星墨壅鏊笪墼塑鱼鱼堕塑鱼堡墨堕墅堕 细胞；术后14t，上皮基本趋于完整，基质层成纤维细胞数量少；胶原纤维排列 疏松。生理盐水组：术后