山桃醇腈酶基因iPdHNL1i的克隆、序列分析与原核表达.pdfVIP

— ２０— 江苏农业科学　２０１５年第４３卷第７期 傅江燕，徐　晟，夏　冰，等．山桃醇腈酶基因ＰｄＨＮＬ１的克隆、序列分析与原核表达［Ｊ］．江苏农业科学，２０１５，４３（７）：２０－２４． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１５．０７．００６ 山桃醇腈酶基因ＰｄＨＮＬ１的克隆、序列分析与原核表达 傅江燕，徐　晟，夏　冰，汪　仁 （江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京２１００１４） 　　摘要：以山桃叶片为材料提取ＲＮＡ，反转录后得到ｃＤＮＡ，通过ＰＣＲ扩增得到１个山桃醇腈酶基因全长编码序列， 并命名为ＰｄＨＮＬ１。ＰｄＨＮＬ１的开放阅读框为１７３７ｂｐ，预测编码蛋白包含５３９个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明， ＰｄＨＮＬ１编码的蛋白具有葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶的序列特征，与黑樱桃醇腈酶ＰｓＨＮＬ４蛋白相似度为９２％，与桃 假定的ＨＮＬ蛋白相似度为 ７７％。通过将 ＰｄＨＮＬ１基因连接到原核表达载体 ｐＥＴ２８（ａ）上，并转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）后，成功构建了原核表达重组菌株。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果显示，重组蛋白受ＩＰＴＧ诱导表达，分子量大小 约为６２．４ｋｕ，与已报道的其他蔷薇科植物的醇腈酶蛋白大小基本一致。 　　关键词：山桃；醇腈酶；基因克隆；原核表达 　　中图分类号：Ｓ６６２．１０１；Ｑ７８６　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１５）０７－００２０－０５ ［２］ 　　利用酶作为催化剂用于合成单一对映体或直接分离特定 化合物反应生成手性氰醇 ，进而转化成为羟基化合物等多 手性异构体，被广泛应用于不对称合成领域。醇腈酶作为一 种手性中间体，并用于合成多种手性药物，从而克服了为得到 种不对称催化手性反应的酶，自２０世纪初在扁桃中发现以 纯手性化合物而采用光学拆分所带来的生产工序复杂、成本 ［１］ ［３－４］ 来，受到愈来愈多的关注 。它可逆地催化 ＨＣＮ和醛／酮类 高等一系列问题 。此外，在植物体内，醇腈酶可催化氰基 糖苷类化合物，反应生成羰基化合物和ＨＣＮ，而后者在植物 收稿日期：２０１５－０１－３１ 防御草食类动物摄食或其他致病菌感染中起到作用，即植物 基金项目：国家自然科学基金（编号；江苏省中国科学院 ［５－６］ 的生氰作用 。 植物研究所青年基金（编号：２０１２０１）。 ＨＮＬ在自然界中是广泛存在的。据统计，有 ３０００～ 作者简介：傅江燕（１９９０—），女，江苏南京人，硕士研究生，主要从事 １２０００种植物内含有ＨＮＬ。ＨＮＬ主要分为两大类：Ｒ构型和 植物功能基因克隆及功能验证方面研究。Ｔｅｌ：（０２５ Ｓ构型。目前，已分离纯化并进行酶活分析的Ｒ型ＨＮＬ多来 Ｅ－ｍａｉｌ：ｈａｐｐｙｄｅｄｕｃｋ＠１２６．ｃｏｍ。 ［７］ 自于蔷薇科植物 ，如扁桃、黑樱桃、梅、枇杷、西番莲 通信作者：汪　仁，博士，副研究员，主要从事植物分子生物学方面研 ［８－１３］ 等 ；而Ｓ型 ＨＮＬ多来 自于木薯、橡胶树、海檀木