第三章动物细胞培养总论资料.ppt

动 物 细 胞 特 点 无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢 需氧量少，对搅拌敏感 聚集体形成 原代细胞培养50代即开始退化 一、基本概念： 动物的体外培养分为： 细胞培养、组织培养和器官培养。 1、细胞培养：将动物的某一组织取出， 使其分散成单个细胞，在人工条件下（无菌、适当温度和一定营养条件下）使之存活、生长和增殖的技术。 2、组织培养： 将动物的组织取出，在模拟体内生理环境下，在体外的人工条件下生存和生长， 并维持组织的结构和功能不变的技术。 组织培养与细胞培养的关系 在组织培养过程中，由于现有的培养手段还不能长期维持组织的结构和功能不变，动物细胞往往会从组织中迁移生长出来，在组织周围形成一圈单层贴壁生长细胞，这圈细胞又称为生长晕。 组织培养最终变成细胞培养。 3.器官培养： 培养对象是器官的原基、器官的一部分或整个器官， 放在模拟体内的生理环境的体外，使之存活、生长并保持一定功能的技术。 4.器官培养和细胞培养区别 抑制细胞从器官培养物中迁移出来。抑制细胞的脱分化，维持器官培养物的结构和功能不变，维持细胞的分化状态。 5、组织工程的意义： 应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 组织工程的基本方法： 是将体外培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生物相容性良好、并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质上。该材料可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，使细胞按预制形态的三维支架生长。然后将这种细胞生物材料复合体植入机体病损部位，在生物支架降解吸收过程中，种植的细胞继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。 二、动物细胞培养的研究历史 1885年， Roux将鸡胚神经板在温暖的生理盐水中培养几个月，首次提出组织培养的概念。 1907年，Harrison 的髓管培养试验，将蛙胚的神经管的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，从细胞中长出轴突——这是公认的组织培养的真正开始。 1912年，Carrel 将无菌操作引入组培试验 另外，他将7天的鸡胚心肌组织块包埋培养于血浆和鸡胚提取液，观察到心肌细胞搏动达104天， 并采用更新培养基和将原代细胞传代 的培养措施，从而解决了细胞体外长期生存的营养问题。 1951年，Eagle,研发人工合成的培养基。 1975年，Sato 用激素、生长因子代替血清，开发了成分明确的培养基。 三、动物细胞的生长特性 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。如：人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞。 悬浮生长： 在悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。如血细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞 细胞培养方式： ? 群体培养（mass?culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞。； ?克隆培养（clonal?culture）：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。 一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。 体外细胞生长增殖过程 ※ 原代培养期(primary culture) ： 从肌体取得材料（ 细胞，器官或组织）在培养瓶内培养到第一次传代前的这个过程称为原代培养 。又称初代培养。 8、 定义： 胚胎干细胞（ES细胞）又称多能干细胞（PSC）,是胚胎或生殖细胞经体外抑制分化培养后，筛选出的具有全能性的细胞。 历史： Evans和Kaufman(1981)首次从小鼠的胚胎中分离得到小鼠ES细胞。后来又分离得到许多其他动物（猪、牛、绵羊、山羊、家兔、水貂、仓鼠以及人）的ES细胞。但以小鼠的ES细胞分离方法最成熟。 取材： 取到具有发育全能性的细胞或细胞团进行分化抑制培养 1、早期胚胎获取及处理方法； 小鼠－3.5d囊胚或2.5d桑椹胚（16～20细胞） 猪－ 9～10d囊胚； 兔－ 3～4d囊胚； 牛－ 6～7d桑椹胚或7～8d囊胚； 绵羊－ 8～9d囊胚 二、分化抑制培养饲养层、条件培养基、分化因子 1、饲养层：用丝列霉素C处理细胞单层，阻断细胞有丝分裂