体外模拟心脏微境诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究.pdf

华中科技大学同济医学院 硕士研究生论文 一、英文缩略语 BSA Albumin，BovineSerum 牛血清白蛋白 CD clusterofdiffercntiation分化群 eTnT Cardiac T 心肌肌钙蛋白．T troponin DAPI 4， 6-二乙酰基一2一苯基吲哚 4’，6-diamidino一2-phenylindole DM匝M dulbecco’smodifiedmedium eagle’s Dulbecco改良eagle培养基 皿S fetal190viescro．m 胎牛血清 MSCs stemcells 骨髓间充质干细胞 mesenchymal NBCS Born New CalfSerum 新生牛血清 PBS solution 磷酸盐缓冲液 phosphate-balanced Rpm revolutionsminute 转数／分钟 per 华中科技大学同济医学院 硕士研究生论文 体外模拟心脏微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分 化的实验研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科 硕士研究生 陈军 导 师 张凯伦教授 中文摘要 目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)、大鼠乳鼠心肌细胞、心脏成纤 维细胞在体外分离、培养的方法及大鼠骨髓间充质干细胞的标记方法；观察骨髓问 充质干细胞、大鼠乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的生物学特性；探讨心肌微环境 中与诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化相关的因素，为MSCs在心 肌梗死类疾病中的临床应用提供实验依据。 方法提取成年大鼠骨髓全骨髓培养法通过多次传代获取纯化的MSCs，经 DAPI标记后分别与经胰蛋自酶顺序消化法及差速贴壁法获得的新生大鼠心肌组织 内的心肌细胞和成纤维细胞体外共培养，同时分别收集心肌细胞和成纤维细胞培养 上清液来制备条件培养液并作为条件培养基培养MSCs用以模拟心肌内微环境的不 同成份对MSCs的作用。通过相差显微镜观察细胞形态学变化，荧光显微镜观察 DAPI标记MSCs的效果，免疫荧光法分析共培养及条件培养后MSCs的心肌特异 性抗原(肌肌钙蛋白)的表达以鉴定其向心肌样细胞分化情况。 结果全骨髓培养法培养的骨髓间充质干细胞纯度高、细胞增殖能力强、细胞 均一性较好。DAPI标记的MSCs荧光显微镜下发出明亮的蓝色荧光，标记率几乎 100％，持续1周仍明显可见。培养的心肌细胞纯度达70．80％，贴壁生长良好培养， 第3天就开始自发搏动，可持续2周。心脏成纤维细胞体外培养生长良好。心肌细 胞直接接触共培养的MSCS有一部分表达心肌特异性肌钙蛋白T，而在其他培养 条件下未发现MsCS表达心肌特异性肌钙蛋白T。 结论全骨髓培养法是一种简便易行、有效分离骨髓间充质干细胞的方法； 2 华中科技大学同济医学院 硕士研究生论文 DAPI可以用来作为标记MSCs的一种有效手段；胰蛋白酶顺序消化法及差速贴壁 法能有效分离培养心肌细胞和心脏成纤维细胞；MSCs与心肌细胞间的直接接触是 心肌微环境