第五章细胞融合资料.pptVIP

第五章 细胞融合 又称体细胞杂交(Somatic hybridization) 是指将不同来源的原生质体（细胞）相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。 人们很早就发现在生物界中有自发的细胞融合现象。我们知道，无论是远缘杂交还是利用多倍体技术都要先实现有性杂交，而亲缘关系较远的物种间杂交往往表现为杂交不亲合或不能受精或是胚胎早期败育。 克服远缘杂交中的不亲和障碍； 优良性状改良 组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的新品种。 进行体细胞融合就可以避开生殖细胞的受精过程。避免上述种种麻烦，从而在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。 例如，马铃薯和番茄通过细胞融合得到了至今有性杂交未能获得的属间杂种薯番茄和番茄薯。 存在问题 （1）通过融合将双亲的染色体组相加，往往会造成遗传上的不稳定，杂种细胞也不易分化成株。 (2)从野生种带进过多的不良基因 1、对于植物细胞而言，一般先得到原生质体 2、通过物理或化学方法诱导细胞融合形成杂种细胞 3、进行杂种细胞的分检和培养 4、促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的转移 由于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是一个新的物种或品系。 5．3 基本原理 细胞可以发生融合的生物范围是很广的。到目前为止、已经在种间、属间、科间以及动植物两界之间都做过细胞融合的尝试，但只有体细胞的无性杂交才是真正意义上的细胞融合技术。 融 合 过 程 细胞融合主要经过了以下4步： 两原生质体或细胞互相靠近 细胞桥形成 胞质渗透 细胞核融合 其中细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步 5．4．1 植物或微生物原生质体的制备 植物和许多微生物细胞外有一层坚韧的细胞壁，为了促使这样细胞的融合就必须先得到单个细胞，除去细胞壁，才能获得植物原生质体或微生物原生质球 。因此时于植物和微生物细胞的融合一般又可称为原生质体融合。 5．4．2 动物单个细胞的获得 （一）组织的获得 (二)组织的消化 物理法 主要包括显微操作、电场刺激等； 化学法 主要是用聚乙二醇PEG结合高PH、高钙离子法； 生物法 有仙台病毒法等。 具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。 诱导动物细胞融合 仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合法都适用 植物细胞融合 常用PEG法和电融合法； 微生物细胞融合 只适用PEG法 我们知道很多病毒都具有凝集细胞的能力。它一边黏接在一个细胞表面，另外一边黏接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。 仙台病毒也称日本血凝病毒HVJ,属黏液病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。 由于被感染细胞表面发生某些改变，使得这些细胞容易发生融合，甚至处死的HVJ病毒也具有促进细胞融合的作用。 日本学者冈田利用仙台病毒使两种不同的动物细胞之间发生凝集，进而融合成一体。 研究发现：促进细胞融合的有效部位在于病毒的膜，被超声波打碎的病毒膜片仍具有促进细胞融合的功能。 仙台病毒促使细胞融合的因素与病毒被膜上的磷脂成分有关，而与病毒内核酸的活性无关。 仙台病毒被膜糖蛋白与其促融合的能力有关。在动物细胞融合中，仙台病毒(HVJ)已成为产生细胞杂种的标准融合剂。 病毒促使细胞融合的主要步骤： (1)两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近 (2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用是两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透 (3)两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体 (4)进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。 细胞融合中的化学法诱导主要包括： NaNO3诱导 NaNO3能中和原生质体表面负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率低。 高Ca2+和pH诱导法 PEG诱导 PEG结合高Ca2+和PH诱导法 上面几种方法中以PEG结合高Ca2+和PH诱导法最为常用，下面做重点介绍： ： 5．5．2．1 基本原理 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，商品名卡波蜡，实验室用的PEG ，平均相对分子质量在200-2000之间，一般1000以下者为液体，1000以上者为固体。 1974年人们用它诱导大麦、大豆植物原生质体融合，以后又用PEG诱导与用高Ca2+和P