第八章亲和纯化资料.pptVIP

生物分离技术（10） 微生物应用技术专业2009级 教室：2302 第八章 亲和纯化 概念 利用生物分子间特异性结合的原理进行物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术(Affinity purification)，其代表性的方法为亲和层析法(Affinity chromatography)。 生物物质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性，即生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。 生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用(bioaffinity)或简称亲和作用(affinity)，通过亲和作用发生的结合称为特异性结合(specific binding)或亲和结合(affinity binding)。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术(Affinity purification)，其代表为亲和层析法(Affinity chromatography)。 一、生物亲和作用 1、亲和作用的本质 亲和作用是自然界普遍存在的现象，只是生物分子间的亲和作用具有更高的选择性。一般如不特殊说明，亲和作用均指生物分子间的特异性结合作用。 蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构，能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好可以进入到此凹陷结构中，或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入与其发生亲和作用的分子(一般也是蛋白质)的凹陷部位，就象钥匙和锁孔的关系一样。 蛋白质分子表面的凹陷或凸起部位与整个蛋白质分子相比要小得多，由于不是整个分子或物质参与亲和结合，亲和作用的分子(物质)对可以是：大分子—小分子，大分子—大分子，大分子—细胞，细胞—细胞。 具有亲和作用的分子(物质)对之间具有“钥匙”和“锁孔”的关系。 除此之外，还需要分子或原子水平的各种相互作用才能完整地体现亲和结合作用。这些相互作用包括以下几个方面。 1.1静电作用 亲和作用分子对的结合部位上带有相反电荷时，产生静电引力。 在中性pH下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸等酸性氨基酸残基可带负电荷，而精氨酸、赖氨酸和组氨酸等碱性氨基酸残基可带正电荷。 此外N末端氨基酸的?—氨基带正电荷，C末端氨基酸的羧基带负电荷。 1.2氢键 如果亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或氮原子，结合部位之间可以产生氢键作用，即形成O…H—O (0.26nm)或O…H—N (0.28～0.30nm)。 1.3 疏水性相互作用 如果亲和作用分子对的一方分子上含有芳香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部位上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用。 1.4 配位键 如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位，则两者之间可通过金属配位键间接结合。 1.5弱共价键 弱共价键是指结合力较弱的可逆共价键， 如氨基与甲酰基之间形成的Schiff碱(Schiff base)，醛基与羟基之间形成的半缩醛基(hemiacetal)均为可逆共价键，结合力较弱。当亲和作用分子对之间满足形成弱共价键的条件时可能形成弱共价键。 如果亲和结合作用主要源于静电引力，则提高离子强度无疑会减弱或完全破坏亲和作用。 由于氢键的形成同样基于静电引力，因此提高离子强度也会降低或消除氢键作用。 与静电引力相反，疏水性相互作用随离子强度提高而增大。因此，当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用时，增大离子强度则可提高亲和结合作用。 2.2 pH 蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同解离基团的解离常数(pKa)不同。 如果静电引力对亲和结合作用的贡献较大，则pH将严重影响亲和作用，即在适当的pH下亲和结合作用较高，而在其他pH下亲和结合作用减弱或完全消失。 2.3 抑制氢键形成的物质 脲和盐酸胍(guanidinohydrochloricacid)的存在可抑制氢键的形成。 因此，如果亲和结合作用中存在氢键，则加入脲或盐酸胍可减弱亲和作用。 但是，脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂，高浓度下容易引起蛋白质的失活或变性。 2.4 温度 由于温度升高使分子和原子的热运动加剧，结合部位的静电作用弱。但温度上升可使疏水性相互作用增强. 2.5 离液离子 在SCN-，I-和CIO4-等离子半径较大的离液阴离子存在下，疏水相互作用降低。 因此，如果疏水相互作用对亲和结合的贡献较大，则添加这些离子会降低亲和结合作用。 2.6 螯合剂 如果亲和结合作用源于亲和分子对与金属离子形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂除去金属离子，可使亲和结合作用消失。 酶反应的底物特异性即反映在一种酶仅与特定的物质(底物)相结合并催化该物质发生的特定反应。 此外，酶反应的可逆竞争性抑制剂和底物一样与酶的活性部位