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第十二章 核酸的研究方法 * * 一.核酸的分离，提纯和定量测定 （一）DNA的分离提纯 真核生物DNA与蛋白质的复合物（DNP）溶于水和浓盐溶液，但不溶于0.14mol/L盐溶液，用苯酚或氯仿使蛋白质变性，DNA溶于上清液。 在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下用蛋白酶消化细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA，操作在低温下进行，防止过酸，过碱，或机械振荡，可得高质量的DNA。 （二）RNA的分离提纯 RNA易被广泛存在的RNase水解，所有器皿与溶液都要经过处理除去RNase，在破碎细胞的同时应使RNaes失活，在实验反应体系中要加RNaes的抑制剂。 目前常用的分离方法——为釽盐/氯化铯密度梯度离心（RNA密度1.89，DNA密度-1.71，蛋白质密度1.33）。另一为酸性釽盐/酚/氯仿法。 （三）核酸含量的测定法 利用碱基，糖和磷酸基进行测定。 紫外分光光度法：利用碱基260nm 紫外吸收测定核酸含量。 定磷法（钼蓝比色）：浓硫酸水解核酸之磷酸，酸性条件下磷酸与钼酸形成磷钼酸，用还原剂还原磷钼酸为钼蓝，660nm比色测定含量。 定糖法 RNA：核糖与盐酸共热生成糖醛，然后与地衣酚生成鲜绿色化合物，670nm比色测定含量。 DNA：脱氧核糖与二苯胺共热生成蓝色化合物，595nm比色测定含量。 生物组织 冷的稀酸抽提 酸溶性物质 残留物 有机溶剂抽提 脂类物质 残留物 碱法 热酸法 冷酸法 碱降解再酸化 热酸提取 冷酸提取 酸提取液 残留物 残留物 酸抽提液 残留物 酸提取液 （RNA） （DNA） （RNA+DNA） 热酸 （RNA） 提取 残留物 酸提取液 （DNA） (1)热酸法 把组织预处理后的沉淀部分用稀的过氯酸（PCA）或三氯乙酸（TCA）在90 ?C处理15min，两种核酸皆成为酸溶性物质而抽提出来，并与大部分不溶性的蛋白质分开。 优点：无蛋白质干扰，迅速简单 缺点：没有把DNA与RNA分开，准确度较差 (2)冷酸法 经酸和有机溶剂处理后用1mol/L PCA于4 ?C处理18h抽提出RNA，再用0.5 N PCA在70 ?C处理20min抽提出DNA。各抽提液用定磷法，定糖法或紫外分光光度法来测定。 优点：可测定微量 缺点：可能部分DNA混杂于RNA中 （3）碱法 将酸不溶的非脂类含磷化合物与1N氢氧化钠在37 ?C保温过夜，RNA被碱解为酸溶性核苷酸，而DNA不被分解。加入PCA或TCA酸化后，DNA即沉淀下来，上清液中为RNA的酸解产物。 优点：将DNA和RNA分开 缺点：RNA部分还有其他含磷化合物 二.核酸的超速离心 当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。 物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。 1)扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。 2)沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。 3)利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。 离心就是利用离心机转子高速度旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。 超速离心机 密度梯度沉降平衡法 1.核酸密度的测定 当DNA样品的沉降速度与扩散速度达到平衡状态时，DNA形成一稳定的区带，漂浮于氯化铯密度梯度中的一定位置上。此时DNA所处的位置上的氯化铯密度等于DNA的浮力密度。 用1-2个已知浮力密度的标准DNA样品作参考，与未知样品一起离心。 2.测定DNA中G-C之含量 G-C碱基对比A-T碱基对之密度大，含G-C对多的DNA，浮力密度大。而且G-C的百分含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系。 3.溶液中核酸构象的研究 4.用于核酸的制