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pGEX-4T-2-TK原核表达质粒的构建及其表达 摘 要 目的：近年来，肿瘤的基因治疗一直是人们研究的热点。为了探索自杀基因 在肿瘤治疗中的应用，本实验选择具有较好安全性，重组后能很好表达的 原核表达质粒西娶苎二篮=至迮为构建重组质粒的毯体，以其表达产物能将无 毒的前体药物更昔洛韦(Gcv)转化成细胞毒性产物(--磷酸更昔洛韦)的 自杀基因一差纯疸窒痘耋胞萱邀酶茎圈(HSV—TK)作为旦鳆薹圉，用分子生 杆菌BL21(DE3 目的蛋白表达情况及体外对鼻咽癌CNE-2细 胞的杀伤作用， 入双歧杆菌后能否靶向表达于肿瘤乏氧区的 后续实验做准备。方法：用小量制各质粒DNA的方法分别提取表达型质粒 ＼7K／ 酶BamHI和Sal I酶切点。纯化后的表达型质粒载体pGEX-4T-2与自杀基 I和Sal 因HSV—TK分别用限制性内切酶BamHI进行双酶切后连接。将连接 养基筛选出阳性转化菌菌落，扩增后再提出质粒行双酶切鉴定，PCR鉴定 以及送英骏公司进行测序鉴定，将鉴定正确的阳性菌用IPTG(异丙基一13一D一 硫代半乳糖苷)诱导表达后，一部分行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白 表达情况，同时另一部分添加终浓度为lrmol／L的更昔洛韦，厌氧罐厌氧 培养24h后取细菌悬液10ml，离心收集上清液，真空干燥，残渣用无菌0．9 ％生理盐水iml溶解，由此获得处理液。同时以培养基、单纯阳性菌处理 液组及单纯GCV组作对照，处理方法同上。各取200肛I处理液作用于培养 法观察各组鼻咽癌细胞存活率。结果：(1)挑取抗氨苄青霉素的单个阳性 转化菌菌落，扩增后提取重组质粒行双酶切，然后行l％琼脂糖凝胶电泳 司进行测序鉴定，通过两个测序反应得到两段碱基序列分别为854bp和 872bp，去除测序引物并且连接后得到1 软件分析示与GENEBANK上公布的原序列一致，无开放读码框架移位及改 胺凝胶电泳，较未添加IPTG组可见目的蛋白条带产生，说明构建的原核表 达质粒成功，经诱导后可以表达目的蛋白，达到实验要求。(5)体外WST-1 统计软件进行单因素方差分析，实验组与各对照组进行组间比较，pO．05， 有统计学意义。采用析因方差分析，单纯阳性菌组与单纯GCV组交互作用 后与阳性菌+GCV组相比较，P0．01，有统计学意义，表明实验组抑瘤结果， 不是阳性菌组及GCV组抑瘤结果的简单相加，而是阳性转化菌表达的产物 作用于前药GCV，使其磷酸化为对细胞有毒性的三磷酸更昔洛韦，从而大 组质粒，经限制性核酸内切酶双酶切鉴定，特异性PCR扩增鉴定，及测序 物序列与GENEBANK上公布的原序列一致，无开放读码框架移位及改变， 无基因突变；(2)将构建好的重组质粒成功转入大肠杆菌后自杀基因能表达 目的蛋白，阳性菌与GCV共同培养后获得的处理液对CNE．2细胞有明显 的抑制作用。 关键词：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，表达型质粒载体pGEX．4T．2，肿瘤 靶向，自杀基因疗法 Constructionand of ExpressionpGEX-4T-2-TKprocaryon recombinant plasmid ective：Toconstruct recombinant ABSTRACT：obj procaryon plasmid( anddetectits inBL21(DE3)Ecoli．Wechoosetb pGEX-4T-2一TK expression vector and virus procaryonexpressionpGEX-4T-2herpessimplextype] kinaseas toconstructrecombinant thymidi