在体肝癌hep2细胞ier5基因辐射效应及其启动子区域的研究.pdf

中文摘要 在体肝癌HepG2细胞IER5基因辐射效应及其 启动子区域的研究 摘 要 原发性肝癌(简称肝癌)位居全球恶性肿瘤发病率的第 6位，新发肝癌病例中55％发生于中国，其年死亡率占我国 各种癌症死亡率的第2位，是我国最常见的消化道肿瘤之 一。常用的肝癌非手术治疗方法有：肝动脉栓塞化疗、瘤内 无水酒精注射、射频消融等，疗效均不理想。放疗是恶性肿 瘤治疗的三大手段之一，随着三维适形放疗和调强放疗技术 的发展，放疗在肝癌治疗中的地位被再次提出，近来大量临 床研究证实三维适形放疗能显著提高肝癌患者的中位生存 期和生活质量。目前，可以肯定的讲原发性肝癌属于放疗敏 感肿瘤，放疗己成为肝癌治疗的有力武器。 辐射敏感性是影响肿瘤放疗效果的重要因素之一。为了 增加辐射敏感性、提高肿瘤放疗疗效，人们试图从基因层而 寻找对辐射敏感的基因。如果该基因在辐射之后出现表达变 化，且这种表达变化能够促进肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞 生长，那么该基因对肿瘤放疗就很有意义，由此制定的放疗 方案就有可能很好地提高肿瘤的放疗效果。基于此我们采用 基因芯片技术筛选出辐射可诱导表达的基因，研究发现包括 5)等30个基因在辐射 IER5基因(ImmediateEarlyResponse 后出现了mRNA表达上调。IER5基因属于早期慢反应基因 家族，本课题组的前期研究发现IER5基因存在于一些肿瘤 与正常组织中，可能与细胞周期和细胞凋亡有关。经检索国 内外文献获悉，目前人们对IER5基因研究不是很多，尚缺 中文摘要 乏有关辐射对在体HepG2细胞IER5基因表达影响的研究报 道，对于IER5基因表达调控机制的研究尚为空白。基于此 本课题选择mRNA、蛋白表达、细胞凋亡等实验参数，对 辐射诱导接种人肝癌HepG2细胞的裸鼠肿瘤组织IER5基因 及蛋白表达的影响及辐射诱导该基因表达的启动子区域进 行了探索。 目的： 本课题选择在体HepG2肿瘤细胞作为研究对象，采用 PCR、Western Real．time blot、TUNEL染色等实验方法研究 IER5基因的辐射效应；采用双荧光素酶报告基因技术初步 研究IER5基因辐射应答的启动子区域。 方法： 1 12hll,．t 照射，辐射剂量分别为2Gy禾i14Gy。分别在辐射后4hf[1 PCR实验检测辐射后接 按实验要求取出瘤体，采用Real．time 变化；并在辐射后12h采用Western 方法，对肿瘤组织IER5蛋白表达水平及细胞凋亡情况进行检 测。 列进行启动子生物信息学分析，初步确定IER5基因启动子 列构建一系列缺失体，重组报告基因质粒载体，转染离体 培养的HepG2细胞，通过双荧光素酶报告基因检测方法检 测辐射前后不同缺失体片段所对应的活性，确定与辐射诱 2 中文摘要 导IER5基因表达有关的启动子区域。 结果： 1 Real．time 1．542 组的0．327倍与0．349倍。 Westem blot方法检测蛋白表达水平。结果显示：随着辐射剂 IER5蛋白表达水平明显高于2Gy辐射组。 检测细胞凋亡。结果显示：随着辐射剂量的增加，在体HepG2 表达具有相似的变化趋势，提示我们辐射可能通过上调IER5 基因mRNA和蛋白的表达来增加肝癌细胞的凋亡。我们今后 尚需对此进行更深入的研究。 用双荧光素酶报告基因技术分析和鉴定启动子活性。结果表 该范围内可能存在的调控元件有四个，分别为：TGGCGC、 3