原发性股骨头无性坏死蛋白质组学的实验研究.pdf

中山人学博I。学位论史 ONFH蛋[|质组学的宴验研究 原发性股骨头无菌性坏死蛋白质组学的实验研究 专业名称：外科学(骨外) 博士生：谭 小 云 指导教师：蔡道章 教授 中文摘要 目的 1．应用蛋白双向电泳技术，摸索人血浆蛋白双向电泳分离技术和条件，建立和优 化人血浆蛋白标准电泳图谱；2．以标准人血浆蛋白双向电泳条件及参数为依据， 对正常人群及原发性股骨头无菌性坏死患者的血浆蛋白电泳图谱进行配对分析 比较，寻找差异蛋白质点：应用质谱鉴定技术，对差异蛋白质点进行鉴定；应用 Western Blot技术对所鉴定的蛋白质进行验证；经生物信息学检索，分析所鉴定 的蛋白质在原发性股骨头无菌性坏死病理机制中的作用，从而确立原发性股骨头 无菌性坏死血浆疾病相关蛋白质；3．应用受试者工作特征分析法，对所鉴定的蛋 白质在原发往股骨头无菌性坏死血浆j艋床诊断实验中的作用进行初步评价，为其 进一步临床检验的应用提供参考依据，同时为今后原发性股骨头无菌性坏死的治 疗及各种治疗手段的血浆学疗效评估奠定基础。 材料与方法 IEF Ettan 采用AmershamBiosciences公司IPGPhorSystem进行等电聚焦、the DALTII LabScansoftware进行电泳图像 systent进行垂直电泳；imagescanner 采集，lnVageMaster21}Elite进行图像分析；应用美国应用生物系统公司(ABI) 中山人学博Ij学位论义 ONFH蛋白质组学的实验研究 sequencer(MALDI—TOF protein 数据库同时行蛋白质生物信息学分析；在WesternBlot过程中，应用Bio—Rad湿 式电转仪进行转膜，经封闭、一抗孵育、二抗孵育及蛋白检测等过程，对所鉴定 的蛋白质进行验证；应用ELISA法对所鉴定的蛋白质在原发性股骨头无菌性坏死 osteonecrosiSofthefemoralhead (idiopathic ONFH)临床血浆检验中 Characteristic 的应用进行受试者工作特征(Receiver ROC)分析。所有 Operating 血浆标本均在受检者本人或其家属的知情同意下获取。 1、晨起空腹条件下采集健康志愿者静脉血2ml，离心后收集血浆，Bradford法测 Remove 定蛋白浓度；按AmershamBioscienses公司Albumin／IgGkit试剂盒的操 作说明去除血浆白蛋白和IgG；向上述已去除白蛋白和IgG的滤液中加入4倍体积 的冰丙酮，一200C孵育，2h以上(或过夜)；-40C 用干净的滤纸吸去丙酮液滴，于超净台中风干：在处理好的样品中加入相应IPG 胶条所需的溶胀液，混匀至少30S，室温孵育至全部溶解；以120009速度离心， 5min，以除去杂质和泡沫；根据所选用IPG胶条pH及长度的不同，选用不同的IPG 泡胀槽(IPGHolder)；在泡胀槽阳极附近均匀加入不同浓度的上样液；将IPG 胶条置入胶条槽进行溶胀；结束溶胀后设置不同的IPGphor仪器运行参数进行等 电聚焦；结束后从泡胀槽中取出胶条，进行两次震荡平衡各lOmin。预灌制好 定电泳条件进行垂直聚焦，直至溴酚蓝达胶底线。电泳结束后，对凝胶进行考马 斯亮蓝染色及硝酸银染色；凝胶用图像扫描仪扫描，分析上述不同的电泳条件对 凝胶图像的影响，从而选择出最优化的电泳条件，建立人血浆标准双向电泳图谱。 2、以上述标准人血浆蛋白双向电泳条件及参数为