栉孔扇贝急性病性坏死症病毒基因克隆及核酸诊断技术的建立.pdfVIP

栉孑L扇贝急性病毒性坏死症病毒基因克隆 及核酸诊断技术的建立 摘 要 给我国贝类养殖业造成了巨大的损失，通过流行病学调查、病理学分析和人工感 染实验已经证实是由栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒(怂，NV)造成的。本研究 利用差速离心和蔗糖密度梯度离心分离纯化AVNV后，用蛋白酶K裂解法抽提 II反转 库，通过蓝白斑显色、PCR反应和酶切分析相结合筛选阳性重组子，测定了重 组cDNA克隆的部分序列并进行了序列分析，最终从中筛选出23#、52#特异重组 eDNA克隆。 在23#、52#重组质粒基础上，设计2对特异性引物，预计目的产物分别为 RT-PCR检测方法，本方法具有较高的灵敏度和较强的特异 准确、灵敏的AVNV 性，以P23F、P23R为特异性引物的RT—PCR检测AVNV RNA的检出灵敏度为lpg， 以P52F、P52R为特异性引物的RT—PCR检测AVNVRNA的检出灵敏度为100pg， 与栉孑L扇贝闭壳肌基因组DNA无交叉反应。 进行验证，结果表明，23#、52#探针都具有较高的灵敏度和较强的特异性，分别 无交叉反应。利用该法检测栉孔扇贝样品，结果显示栉孔扇贝的外套、鳃、‘肾、 消化腺都显示阳性杂交信号，生殖腺、闭壳肌未显示杂交信号。 斑点杂交检测方法是2种快速、灵敏和特异的检测AVNV的方法，发展和完善 这2种技术对栉孔扇贝急性病毒性坏死症的早期诊断和防治及抗病育种具有重 要意义。 关键词：栉孔扇贝；急性病毒性坏死症病毒；cilIA文库；克隆；逆转录聚合酶 链反应；斑点杂交 PartiaI ofthe GenomeoftheAcute Cloning ViraI NecrobiotiCVirusfroB the Nucleic Chlamys厅厂厂e厂，and Acid Methods Diagnosing AiHai—Xin(AquacuIture) Di rected Associ ate by Boffi nWangChong—ming Associ ate ProfessorLi Yun Abstract viral Itistheacute neerobiotic causesthe massivedeathof virus(AVNV)that thecultured inthecoastof since1997．AVNVis scallop，Chlamysf西7eri Shandong isolatedand frommoribund differential purified scallop(Chlamysfa