药物诱导大鼠骨间充质干细胞向成骨细胞转化的实验研究及鉴定.pdfVIP

中文摘要 药物诱导大鼠骨髓问充质于细胞向成骨细胞 转化的实验研究及鉴定 摘 要 目的：骨髓组织中含有两种干细胞成分即造血干细胞和 骨髓间充质干细胞。骨髓中的间充质干细胞不仅能产生造血 细胞的微环境，辅助骨髓造血，而且还可以分化成各种胚层 细胞，它以无可比拟的优越性成为组织工程种子细胞的理想 来源。本实验采用Percoll密度梯度离心、贴壁筛选法及单克 隆培养法，分离、培养、扩增出高度同源性的大鼠骨髓间充 大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性，并将其向成骨细胞定 向诱导分化为进一步的研究其作为骨组织工程的种子细胞 打下基础。骨髓间充质干细胞(MSCs)位于骨髓的基质细 胞系中，在体外可以通过贴壁培养加以分离，由于其分裂增 殖能力强，可以分化为多种结缔组织细胞，形成骨、软骨、 肌腱、肌肉、脂肪、神经等，并易于被外源基因转染并稳定 表达。 现在临床患者中以各种原因引起的骨组织缺损或不同 疾病侵蚀所造成的骨损伤，医务工作者急待有新的治疗方法 的出现，改善目前临床上常用死骨摘除、假体置换等等方法 治疗，对一些患者来说，这些疗法损伤较大且疗效不甚理想， 并有一定的经济负担，不少患者放弃手术而采取中药保守治 疗。在重大的责任压力面前，研究者们不断研究探索，采用 骨髓分离细胞加以纯化，增殖培养等方法，对极少量的骨髓 中文摘要 间充质干细胞进行扩增，药物诱导，结果可得到大量较纯的 骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞。为临床开辟了治疗骨缺 损后新的、有效的治疗方法。 骨髓中MSCs含量虽然很少，约占骨髓内单核细胞总数 强大的分化潜能，可以在体外扩增，由它诱导的组织细胞进 行移植时不存在组织配型和免疫排斥反应。因此，在骨组织 工程学中，骨髓间充质干细胞(MSCs)成为研究骨缺损和骨坏 死修复的热点。 本实验旨在通过研究建立大鼠骨髓间充质干细胞体外 分离培养方法体系，探讨其向成骨细胞分化的最佳诱导条 件，为今后的进一步动物实验以及未来用于人类骨科疾病的 临床治疗奠定基础。 方法：大鼠断颈处死，无菌条件下，取股骨和胫骨的骨 筛选法分离出骨髓间充质干细胞作为原代细胞，将其置于 37℃，饱和湿度5％C02的常规条件下培养，选择P2代细胞， 待进入对数生长期后用于实验。 颈处死，在75％的乙醇中浸泡5分钟，四肢固定于蜡盘上， 碘酒消毒，剪开下腹部皮肤，暴露出股骨和胫骨，尽量剔除 干净骨膜和软组织，剪开骨头两端，露出骨髓腔。用肝素 ．Hanks混合液(1：9)冲洗骨髓腔，反复数次。收集此骨髓液 以2000转／分钟转速离心20分钟，吸取液面交接处的单个核 中文摘要 X 整细胞浓度为1 105／m，接种于25ml塑料培养瓶。每日镜 下观察细胞生长情况。 2．MSCs的鉴定：包括形态学观察，细胞周期的检测，流式 测(细胞生长曲线)，甲苯胺蓝染色。 度为5×105／ml接种于6孔板中，按加入诱导剂中地塞米松 个常规培养的对照组进行培养，隔日换培养液一次，每日在 倒置显微镜下观察细胞生长情况。 4．成骨诱导分化后的鉴定：包括形态学观察，Giemsa染色 法，碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定，I型胶原的免疫 组织化学染色，茜素红钙节结染色。 原 结果：1．骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养与观察 代MSCs细胞接种后2～3天，倒置显微镜下可见单个细胞贴 壁生长，3天后首次换液，部分细胞形成集落，增殖迅速， 成放射状向周围扩展。以后隔日换液一次，培养至12～14天， 达到80％,-00％融合，呈旋涡状或束状排列。而且位于培养 瓶边缘的细胞密集，长势优于中央部位的细胞集落，即出现 细胞边聚现象；细胞呈纺锤形、梭形、多角形等，细胞间界 限清晰，胞浆饱满，胞核圆形，居中或偏于细胞一侧，单个 或多个核仁，生长期细胞分裂相多见。细胞传代至4代后， 细胞增长速度减慢、细胞体积增大，胞浆折光度减弱、开始 出现小空泡，提示细胞老化。 2．MSCs成骨诱导和细胞形态观察MSCs经成骨诱导后，