骨重塑在造血干胞动员中的机制及应用研究.pdf

Y1 目 录 第一部分骨重塑在∽sF诱导的造血干细胞动员中的作用机制研究 摘要………………………………………………．．1 材料与方法……………………………………………．7 结果…………………………………．……………17 讨论………………………………………………．27 小结………………………………………………．29 参考文献……………………………………………．．29 第二部分靶向于骨龛的治疗保护造血干细胞功能 摘要………………………………………………．34 引言………………………………………………．．37 材料和方法……………………………………………38 结果………………………………………………．45 讨论………………………………………………．49 小结………………………………………………．50 参考文献……………………………………………．．50 英文缩写词………………………………………………54 致谢…………………………………………………．75 学术成果………………………………………………．．76 的作用机制研究 摘要 目的骨髓中大多数造血干细胞位于骨组织构成的骨龛中。成骨细胞是骨内 膜表面的内衬细胞，生理条件下HSC及移植后归巢至骨髓的HSC与之密切接触， 这种解剖定位提示成骨细胞可能调节HSC的功能。这一观点首先在成骨细胞和 HsC的体外共培养中得到证实，随即一系列的研究几乎同时确定：成骨细胞是HSC 龛中一关键组成成分，目前人们将之命名为‘成骨细胞龛’或‘骨内膜龛’。通 过调节‘骨内膜龛’的大小，可以控制HSC的数量，维持HSC的稳定状态1。本 研究以干细胞动员中的成骨细胞及破骨细胞为研究对象，观察干细胞动员过程中 成破骨细胞数量和功能的变化及其与动员的关系，进一步研究造血干细胞动员的 机制。 方法利用流式细胞术检测动员0、3、5天小鼠外周血干细胞数量，评价动 员效果；通过实时定量PcR的方法比较动员O、3、5天小鼠成骨细胞特异性基因 ocN、0PN、SDF_1、SCF的水平；并通过免疫组化及流式细胞术比较动员O、3、5 天人类及小鼠成骨细胞数量功能的差异：利用细胞化学TRACP染色的方法比较动 员0、3、5天小鼠破骨细胞数量和功能的差异；利用连续切片标记Caspase3的 方法检测人类及小鼠成骨细胞的凋亡情况；利用ELISA的方法检测人类及小鼠循 环中ocN、TRAP一5b蛋白水平反应成破骨细胞活性；共培养小鼠成骨细胞和小鼠 骨髓有核细胞，检测成骨细胞活性。 结果 1．短期应用G-CSF可导致人类和小鼠动员模型中干骺端成骨细胞数量减少 活性下降：动员前小鼠成骨细胞OCNmRNA水平为动员第三天的27±6倍(尺O．01)； 且动员后第3天骨内膜成骨细胞数量明显减少，形态由立方形变为梭形；CD45一 cells／femur；动员后3天，1118±80cells／fe删r；动员后5天，1032±55 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 ng／ml(动员后第3天)， 为59．44±3．16ng／m1(动员前)，39．21±4．49 42．36±2．23 ng／m1(动员后第5天)，尺O．01。进一步检测正常供者和自体移植 患者标本同样显示动员后成骨细胞数量减少并伴有活性下降。然而在小鼠G-CSF 动员第3天外周血LSK细胞比例并未明显增加，动员前、动员3天及动员5天分 别为0．40±O．07％、0．55±0．05％和2．9±O．32％，因此成骨细胞的变化发生于动 员之前。 2．成骨细胞数量减少导致SDF一1、SCF、oPN等蛋白表达的减少，动员前小 鼠成骨细胞SDF．1mRNA的表达水平为动员后3天的3．44±O．3倍，进而引起动 ● 员的发生。 3．G-CSF诱导的成骨细胞数量减少功能下降部分是由于动员过程中成骨细 胞发生了凋亡，但成骨细胞