旋毛虫43kd抗原基因重组质粒pet30a（+）-ts43的构建与表达.pdfVIP

塑型盔堂!塑!旦堡兰塑錾兰兰垡迨兰 堂墨皇!!塑!亟堕茎堕垦塑堕塾业!!Q型±2坠塑堕塑堡Ii查姿 硕士研究生 任道锋 导 师 王中全 崔晶 郑州大学基础医学院寄生虫学教研室(郑州450052) 河南省分子医学重点学科开放实验室(郑州450052) 中文摘要 旋毛虫是分布摄为广泛的寄生虫之～，可感染人和150多种哺乳动物。由旋毛虫引 起的旋毛虫病是一种严重的人兽共患病，若不及时诊断和治疗，患者的死亡率可达 3％～30％。自1835年发现旋毛虫病以来，不但未能将该病完全控制，其流行范围反而有 所扩大，现已被列入再度肆虐的疾病。该病不仅严重危害人类健康，也给养猪业和食品 工业造成重大的经济损失。人类主要因生食或半生食猪肉而感染，猪肉中旋毛虫的检疫 对于预防人体旋毛虫病非常重要。因此，目前急需建立一种快速、简单、能够广泛应用 的旋毛虫病诊断和检疫方法。随着分予生物学技术的发展及其在寄生虫学上的广泛应 用，基因重组抗原由于可大量制备、特异性好等优点，有希望用于肉类和肉制品中旋毛 虫的检疫及旋毛虫病的免疫诊断。因此，寻找具有特异性的旋毛虫抗原基因，继而通过 基因工程技术大量制备重组蛋白抗原是当前的研究热点。 本研究旨在应用基因工程方法，通过PcR扩增出旋毛虫肌幼虫的Ts43基因，并通 kDa重组蛋白。通过westem 获得43 blot分析43kDa重组蛋白的抗原活性，为进一步 用于旋毛虫检疫、免疫诊断及疫苗研制打下基础。 材料与方法 cDNA序列，利用生物学软件分析其编码蛋白的二级结构和信号肽区域后设计出一对巢 果币确后测序，并通过生物学软件Omiga2．O对Ts43抗原基因进行序列分析和比较。 DH5d，经抗生素抗性筛选阳性克隆，提取质粒后酶切电泳鉴定重组质粒。 塑型查堂!螋!旦塑主塑塑生兰堡丝塞 整墨皇兰i坚翌羹堕羹婴重型堕垫2兰!!!!f±2娶塑望塑堡兰壅竺 3．旋毛虫Ts43基因的表达与鉴定：携带重组质粒的大肠杆菌BL2l经IPTG诱导 后进行SDs—PAGE，观察有无目的蛋白表达，并对表达结果进行可溶性分析。应用旋毛 虫病患者血清及旋毛虫感染小鼠血清进行Westemblot分析，鉴定重组蛋白的抗原活性。 结 果 1．旋毛虫43kDa抗原最可能的信号肽切割位点位于第22和第23位氨基酸之间。 得到克隆载体片段和Ts43目的基因片段(969kb)，证实Ts43基因的重组质粒构建成功。 核苷酸片段与GenB锄k中报道的序列同源性为99．2％，氨基酸的同源性为98．7％。发现 7个碱基存在差异和4个氨基酸有变化。 4．SDS．PAGE表明Ts43基因在大肠杆菌中获得高效表达，重组蛋白的分子量为 4lkDa，以诱导4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析显示，表达的融合蛋白量约 占细菌总蛋白量的14．7％。 5．westemb10t证实，该融合蛋白可被旋毛虫感染的小鼠血清和旋毛虫病患者血清 识别。与人芽囊原虫、隐孢子虫感染的小鼠血清、正常小鼠血清及健康人血清未发生交 叉反应。然而，旋毛虫重组抗原43kDa与并殖吸虫病、华支睾吸虫病、日本血吸虫病、 囊虫病及包虫病患者血清均有交叉反应。 结 论 核苷酸片段与GenBank中报道的序列同源性为99．2％，氨基酸的同源性为98．7％，并成 功构建重组质粒pET30《+)-Ts43。 2．重组蛋白的分子量为4lkDa，表达的蛋白量占全菌蛋白量的14．7％，表达的融合 蛋白具有较好的免疫反应性。 3．W÷stemblot证实，该融合蛋白可被旋毛虫感染的小鼠血清和旋毛虫病患者血清 识别，但与其它寄生虫病患者妞清有一定的交叉反应。 关键词：旋毛虫；43kDa抗原；表达；交叉反应 Ⅱ 堑!!l查堂!!塑旦坚主堕篓兰鲎堡堡塞 壁墨皇!!坐!垫堕苎里霎里堕垫2坚i!堡：2里!!竺塑堡!查竺 Co