绿色荧光蛋白体转染体内示踪异体骨髓基质干细胞的研究.pdfVIP

中 文 摘 要 fluorescent 目的观察经质粒为载体，脂质体介导的绿色荧光蛋白(green protein， GrP)转染的骨髓间充质干细胞体外表达及体内示踪情况，观察两组骨髓间充质干细胞 肌肉内植入的存活和炎性反应等情况，为骨髓间充质干细胞的异体移植提供实验依据。 方法以质粒病毒为载体，PT67细胞为包装细胞，介导绿色荧光蛋白转染新西兰大白兔 的骨髓基质干细胞，在相差显微镜和荧光显微镜下观察，流式细胞仪检测GFP的表达效 率，G418培养液筛选转染细胞，常规培养。在体外培养的第二代骨髓基质干细胞中加入 含BMP一2的诱导培养基分别在培养2周后，与未转染的同期成骨细胞对照，在相差显 微镜和荧光显微镜下观察，流式细胞仪检测GFP的表达效率，对比转染组与对照组细胞 细胞含量及生长曲线情况，并将转染后的细胞分别植人新西兰大白兔和日本大耳白兔背 部肌肉内，在第3d、1w、3w、5w作活检，利用激光共聚焦显微镜、透射电镜及光学显微镜 观察异体BMSCs存活情况及周围炎性细胞浸润等组织学变化。结果1、骨髓基质干细 胞体外培养后贴壁、集落生长，细胞呈梭形、多角形，有多个大小不一的突起，胞浆淡蓝 色，含有较大的颗粒，核卵圆形，细胞分裂相多见，连续传代培养生长良好。细胞生长曲 线示细胞生长状态良好。培养2周后骨髓基质干细胞表面CD44抗原表达阳性。2、BM— SCs经质粒病毒感染后，植入宿主后24时，冰冻切片后荧光显微镜下即可检测到有绿色 荧光表达，72h表达最强，随着时间推移绿色荧光蛋白阳性细胞均逐渐减少，到5周时仍 可见少量表达。3、术后自体组、异体组移植组动物切口均未出现明显的红肿及分泌物， 无异常死亡。初期HE染色可见自体、异体组细胞炎性反应均明显，有较多炎性细胞浸 润，以白细胞为主，随时间推移植入区炎性反应不明显。结论1、异体骨髓基质干细胞 容易获取、来源充足、可以大量扩增，加入诱导液后细胞形态发生改变并向成骨细胞分 化，可作为骨组织工程的种子细胞。2、GFP基因的导人不会影响骨髓间充质干细胞的活 性和生物学特性，可应用于活体细胞的实时检测。3、BMSC在同种异体组织内可以存活 5周且免疫排斥反应不明显，从而提示异体BMSCs可能具有应用价值。 关键词 骨髓基质干细胞GFP基因转染骨组织工程 researchofGFPastracerofalien Immunity BMSCsafter transplant Abstract To theshort·-termfateoflabeled stemcells Objectivestudy allogeneicmesenchymal intorabbitsubcutaneous intothe tissue，and insights ap- (BMSCs)afterimplantation provide for ofallBMSCsisolated of BMSCstissue First plicationallo—geneic regeneration．Methods fromrabbitfemurmarrowwere BMSCswerelabeledthismethods culture—expanded．Next by thatisBMSCsweretransfectedththerecombinant enhancedfho—