第七章 酶的提取、分离纯化.ppt

 第七章 酶的提取、分离纯化 定义：指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 酶提取时根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 4 酶的分离方法 4、层析分离 5 酶的组合分离纯化策略 6 酶的浓缩、干燥与结晶 * * 1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取 4、酶的分离方法 Go Go Go Go 5、酶的组合分离纯化策略 Go 6、酶的浓缩、干燥与结晶 Go 细胞结构与酶分布 1 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。 酶的纯化过程，分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。 酶分离纯化不同阶段 本章 目录 2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎 JY92-II D超声波 细胞粉碎机 细胞破碎珠 高压细胞破碎机 DY89-I型 电动玻璃匀浆机 机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎 细胞破碎方法及其原理 本章 目录 3 酶的提取 酶的主要提取方法 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 可与水混溶的有机溶剂 有机溶剂提取 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 pH8～12的水溶液 碱溶液提取 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 pH2～6的水溶液 酸溶液提取 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 0.02～0.5mol/L的盐溶液 盐溶液提取 提取对象 使用的溶剂或溶液 提取方法 大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。 本章 目录 1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 Go Go Go Go 5、电泳分离 Go 6、萃取分离 Go 1、沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离 选择性变性沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀 复合沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出 有机溶剂沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出 等电点沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀 盐析沉淀 分离原理 沉淀分离方法 2、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离