临床产esbl大肠埃希菌的耐药特性及基因分型的研究.pdfVIP

临床产ESBLs大肠埃希甍的耐药特性及基因分型的研究 摘要 裔的：研究稳床分离的产超广谱§一内酰胶酶(extendedspectrum Chain 酶链反应(Polymerase NationalComlitteeforclinical 全国临床捡验标准委员会(the Laboratory 种抗菌药物的耐药饿。该实验方法要点：将待测细菌制备成与0．5麦氏标 面，干燥数分钟，耀无菌镊将含蠢氨苄鞭捧、豢啶酸、嚷挝鳆棒、庆大蒜 索、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻膊、头孢他啶、 阿米卡星、氮曲南、头孢吡肟、驻胺培南等药物的纸片分别平贴予舻H培 养基表蘑，簿强纸嚣阕距离不少予24激，纸片孛心疆离乎蘧边缘不少予 15础。将贴蠢药片的平皿鬣于35C孵辅，孵育18h质，用毫米尺测量抑 菌环直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，抑菌环赢径的 大小簸映了测试细菌对测定药物的敏感程度。判断标准参照2004年NCCLS 选试验(screeningtest)：按标准纸片法的规定进行接种，将头弛他啶、 头孢嚷肟、氨曲南和头孢曲松四种抗生索纸片均匀地贴子平板上，35(3孵 育18h蜃，溅量各瓣蓥匿整径，擐据粼糙200矗标准，懿莱头孢德啶≤22 mm，头孢噻脬或氨曲南≤27硼，或头孢曲松《25mm，提示这些菌株为可 test)：按标准纸片法 疑ESBLs产生株。3．纸片确认试验(confirmatory 的规定进行接种，受试菌株同时用将头孢他啶、头孢他啶／克拉维酸的纸煞 h 和头孢噻熙、头孢噻肟／竟拉维酸魄纸片均匀堍贴·予孚扳上，3S℃孵育18 屠，分别测量各撺菌罄盘径，对两令串镊何一个药物，翔克拉维酸后掷菌 霞蠢径与不翔竞拉维酸酌榔蓠圈相比，增大值≥5戳时，初步判定为产 disc ESBLs。4．双纸片协同试验(．double test，DDST)：挑取 synergy 在盘平板上生长的细菌茵落，用无菌生理盐水稀释成m5麦氏比浊标准浓 度的菌液。无菌棉签蘸取适量菌渡均匀涂布予M吨平板。待稍千詹，申央 贴上阿莫酉捧／竟拉维酸纸冀，然后在距该纸篾25疆处(中心一书心)分 别羹占上头憨选松、头孢饱啶、头孢噻肟和氨麴南药敏纸片作为指示帮，35 h观察结架。若指示剂在朝商褥莫语林／克拉维酸方向有撺菌圈 ℃孵育18 扩大的现象(协同现象)，则说明待检菌产生超广谱B一内酰胺酶。5．PCR 扩增：采用UNICP-IO柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA，各标本分别 一3’两对引物扩增blaTEM及blaSHV，扩增片段长度分别为785 bp和848 bp。反应体系：引物各2m，25 mmol／L氯化镁8pl，10mmol／LdNTP2 弘l，lOXbufferlO蛆，5U／¨1 TaqDNA聚合酶0．5沮，质粒DNA模板2p1， 补充去离子水73．5恤l至总体积100 I-q。每株细菌的模板均用TEld引物及 min SHY引物分别进行扩增，总反应体积为i00肛l。反应参数为94℃预变性3 后开始循环，94C变性1 min，56C退火l min，72C延伸lmin，总共为 32个循环，最后72。C延伸10 性对照，产TE妒4和SHV一3标准菌株作阳性对照。用含0．5mg／ml溴化乙