反义bmi-1粒的构建及其对k562细胞增殖的抑制作用.pdfVIP

反义Bm i_1质粒的构建及其对K562细胞增殖的抑制作用 硕士研究生：刘卫红 指导教师：孟秀香 副教授 专业名称：临床检验诊断学 摘 要 目的 白血病是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。抗白血病疗 法一般旨在消灭处于增殖期的细胞，但像正常及白血病造赢干细胞这 样较少处于增殖状态的细胞便能抵抗这种治疗，所以，白血病造血十 细胞特异基因靶点的识别，特别是决定其自我更新基因靶点的识别， 便有可能把白血病阻止在其源头，为白血病治疗提供新的手段。Bmi—l 对于正常和自血病造血干细胞的自我更新至关重要，白血病造血干细 胞或祖细胞如果缺乏Bmi．1会产生明显的增殖障碍，这使得Bmi．1基 因可能成为治疗白血病的靶点。本研究通过构建反义Bmi．】的真核表 细胞中Bmi一1的表达，以观察其对K562细胞生长的抑制作用及其对细 胞周期、p16蛋白表达的影响，从而探讨反义Bmi．1抑制白血病细胞增 殖的作用机理，为白血病的治疗提供新的思路。 方法 1．根据Bmi．1基因已知序列设计合成一对引物，上下游引 Bmi．1基因起始密码子及编码环指结构的核苷酸片段，反向连接于 pLNCX2质粒上得到反义Bmi．1表达质粒。3．在体外转染中通过脂质 体法将质粒导入K562细胞中，以(34t8进行筛选得到阳性克隆。4．以 台盼蓝染色法、MTT法和体外克隆形成实验检测反义Bmi．1表达质粒 对K562细胞增殖的抑制作用。5．利用流式细胞仪分析各组细胞的细 胞周期情况。6．采用免疫荧光组化法检测反义Bmi．1对K562细胞的 ladder法检测细胞凋亡情况。 p16的上调作用。7．采用DNA 结果 1．转染反义Bmi．1表达质粒组与对照组(空白对照组及空 质粒对照组)相比较，生长速度明显变慢，克隆形成能力明显下降， 组K562细胞集落数为(117．0±t．24)／103细胞，转染反义质粒组K562 相比，其Go／G，期所占比例明显上升。3．与对照组相比，反义质粒组 p16蛋白表达明显上调。4．细胞凋亡检测实验的结果表明各组实验细 胞均未出现凋亡情况。 结论本研究构建的反义Bmi．1基因表达载体转染K562细胞后， 对K562细胞的体外生长具有明显的抑制作用，这种对细胞增殖的抑制 作用不是通过细胞毒作用实现的，而是通过上调p16的表达水平、改 变细胞周期使细胞阻滞于G。期来实现的。 反义Bmi．1 关键词：K562细胞 白血病p16 ·2· Ef．fect Inhibition Bmi一1andits Antisense Constructionof inVitro Cells onK562 Liu Postgraduate：WeiHong Xiu Advisor：Professor XiangMeng Medicine Diagnosis Speciality：Laboratory Abstract