单细胞培养资料.pptVIP

1 细胞培养 1.1 细胞培养：将植物体或其培养物游离的细胞或小细胞团进行培养的方法。 培养方式 单细胞培养 悬浮细胞培养 培养对象 细胞个体 细胞群体 培养产物 单细胞克隆系 次生代谢产物 酶制剂、人工种子等 应用领域 筛选突变体， 食品、药品、工业原料、 细胞学研究， 农业生产 进行遗传操作 1.2细胞培养的意义： 2.1 由外植体直接分离 ⑴物理法： 叶片→捣碎→过滤、离心→收集细胞 ⑵酶解法： 2.2 由愈伤组织获得 2、单细胞培养方法： 2.1培养方法 1）平板培养法 2）看护培养法 3）饲喂层培养法 4）微室培养法 2.2 单细胞培养的影响因子 1）细胞植板密度 2）培养基的成分 2.1 培养方法： 1）平板法（plating culture） （薄层培养）1960年Bergamann首创，是在固体培养基中培养单细胞的一种方法。 2）看护培养 1954年，Muir首次创立 此法是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法，这块愈伤组织被称为看护组织 . 愈伤组织不仅为细胞提供了营养，还提供了促进细胞分裂的某些物质 优点：简便、成功率高 缺点：不能在显微镜下直接观察 4）微室培养（microchamberculture 人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称为微室培养法。此法首先是由Jones等（1960）设计 优点：可对细胞培养过程连续进行显微观察，了解一个细胞经过生长、分裂、分化，形成细胞团的全部过程。 缺点：微室培养用的培养基量少，营养和水分就难以保持。pH值变动幅度大，培养的细胞仅能短期分裂。 2.2 单细胞培养的影响因子 （1） 细胞密度与培养基成分关系 当细胞植板密度高时（104～105个/mL） 可使用和愈伤组织培养相同的常规培养基 当细胞植板密度低时 要求使用复杂培养基，常采用KM8P培养基或条件培养基，并结合使用看护培养、饲喂层培养等方法。 （2）细胞密度直接决定细胞分裂与否： ①细胞分裂要求细胞密度达到一定水平； ②细胞会产生某些物质，并分泌到培养基中，只有当这些物质在培养基中达到一定的临界水平，细胞分裂才启动。 生长因子 3、应用——筛选细胞突变体 3.1 突变体的特征 自然界突变体发生频率低 突变体继代多次都能稳定遗传 突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢上的差异 突变体细胞形成的再生植株能通过有性传递保证其突变型 3.2 获得突变体的方法 ⑴自发突变（体细胞无性系变异） 在组培过程中形成的再生植株表现出的遗传变异 特点：自发产生，无外在的选择压力；对于筛选目的突变体有一定的盲目性 适应材料：植物组培的培养物 ⑵诱发突变 人为地采用物理和化学因素，诱发生物体产生遗传物质的突变，经分离、选择、培育成新品种的途径 方法：物理诱变、化学诱变 对象：种子、营养器官、离体培养材料（愈伤组织、单细胞、原生质体） 3.3 细胞突变体筛选的优点与意义（与整体植物相比） 培养细胞壁薄, 缺乏角质层和蜡质层，且处在不断分裂中， 比整体植物或种子更容易接受诱变； 细胞水平诱变周期短，缩短育种年限 ； 处理数目多，收率高； 避免了整株水平上常出现的嵌合体； 节省人力和物力进行选择，筛选效率高； 3.4 细胞突变体筛选的技术路线： 选择起始材料，获得愈伤组织，制备单细胞悬浮系 人工诱变或自发突变 单细胞突变体 筛选有益突变体 单细胞培养，获得克隆 再分化 再生植株 突变株的鉴定 栽培 种苗表型： 抗除草剂、抗盐碱、抗病、 抗氨基酸等 （1）选择方法 ①直接选择：将培养细胞置于一定选择压力之下的选择方法。 选择抗性植株 eg：耐盐、抗除草剂、抗病、抗氨基酸突变体等 小麦耐盐细胞突变体筛选 1.小麦穗（花粉发育到单核晚期）射线辐照诱变。 2.取花药接种在N6+2,4-D2.0+KT0.5+NaCl0.3％上诱导愈伤组织。 3.在去盐培养基上，将上述愈伤组织继代1～3次。 4.移愈伤组织至N6+NAA1.0+KT1.0+NaCl0.3％上分化成苗。 5.将再生植株移栽到盐渍土中，检测其耐盐性。对耐盐好的植株以秋水仙素处理，使染色体加倍。 6.对入选株后代进行耐盐稳定性测定、遗传分析及育种应用。 （2）鉴定方法 ①形态鉴定 ②细胞水平鉴定 ③生理生化鉴定 ④遗传鉴定 嵌合体是指具有不同细胞系的组织共存于同一个体或同一器官之中 （由不同基因型的细胞所构成的生物体） 杂合体是由来自不同的物种的两个配子形成一个合子。一个杂合体的所有细胞来源于这一个合子。 ②间接选择：利用细胞内反应，形成某种有毒物质使野生型被淘汰，从而选出突变体 eg：硝酸还原酶突