毒死蜱降解菌腺苷酸激酶基因的分离及结构特征.pdfVIP

卷 期 草 业 科 学 毒死蜱降解菌腺苷酸激酶基因的 分离及结构特征 齐芬芳 冉雪琴 王嘉福 贵州大学农业工程省重点实验室贵州 贵阳 贵州大学动物科学学院贵州 贵阳 摘 要本研究以 株有机磷农药毒死蜱的降解菌施氏假单胞菌 为研究材料从该菌基 因组中克隆到腺苷酸激酶 基因序列长 包含完整的 基因编码区 编 码 个氨基酸组成的 蛋白经比对分析施氏假单胞菌 的 基因与假单胞菌属的相应基因相似 性最高达 对 的二级和三级结构分析结果显示 蛋白具有典型的腺苷酸激酶结构特点与 同属的 蛋白相比 结构域和 结构域分别有 与 个氨基酸差异这些氨基酸变化可能 与施氏假单胞菌 能够以毒死蜱作为唯一碳源生长的代谢特点有关 关键词有机磷农药降解菌腺苷酸激酶基因 中图分类号 文献标识码 文章编号 腺苷酸激酶 是生物体 基础 内一种重要的核苷酸激酶属于磷酸果糖激酶 家 材料与方法 族 主要催化 的生成反应式为 材料 腺苷酸激酶广 菌株来源 施氏假单胞菌 为贵州大学农 泛存在于微生物植物以及动物体内所有腺苷酸 业工程省重点实验室分离的毒死蜱降解菌 激酶由 个结构域组成 主要试剂 连接酶 聚合 和 酶载体 为 公司产品 结构域根据 结构域的长度将腺苷酸激酶 和质粒提取试剂盒为天根生化科技 分为长亚型和短亚型底物分子与腺苷酸激酶结合 北京有限公司产品 片段胶回收试剂盒由 后 结构域发生很大变化并覆盖整个活性位 公司生产引物由上海捷瑞生物技术有限 点保护 和酶形成的三元复合体 公司合成核苷酸序列的测定工作由北京诺赛基因 协助磷酰基的转移和防水解 腺苷酸激酶以 组研究中心有限公司完成大肠杆菌 或 作为磷酸根的供体维持细胞中 种 为贵州大学农业工程省重点实验室保存 腺苷酸的正常水平对能量代谢和酶活性的调节起 方法 重要作用 本研究中施氏假单胞菌 基因组 的提取 施氏假单胞菌 单菌 为贵州大学农业工程省重点实验 落接种于液体 培养基 条件下 室分离到的一株有机磷农药降解菌能以毒死蜱作 震荡培养过夜取 培养物 离 为唯一碳源生长 在需要高水平 合成 心 去上清沉淀中加入 的 缓冲 和利用的细胞中大量存在并参与细胞中的能量代谢 液反复吹打使之悬浮加入 溶菌酶 和核苷酸代谢低等生物要应对多变的外界环境以 混匀于 温育 加入 及激烈的生存竞争必然要求高度的腺苷酸激酶活 性用以维持体内的能量代谢平衡而关于农药降解 收稿日期 接受日期 基金项目贵州省培育项 目黔教科 贵州省创新 菌中的腺苷酸激酶基因鲜有报道本研究以一株毒 人才团队专项黔科合人才团队 贵州 省自然科学基金黔科合 字 死蜱降解菌 为研究材料克隆 基因并对其 作者简介齐芬芳 女湖南株洲人硕士主要从事微 生物学研究 结构特点进行分析以期为后续的研究奠定一定的 通信作者王嘉福 充分混匀再加入 裂解液混 基因组 为模板经特异性引物扩增获得 匀 温育 离心 取上 的 片段与预期大小相符图 经琼脂 清加入等体积的酚 氯仿 异戊醇 抽 糖凝胶电泳回收目的片段与 载体相连 提 次 离心 取上清加入 经菌落 及质粒提取鉴定阳性克隆子获得阳性 倍体积的异丙醇稍加离心沉淀基因组 克隆 的乙醇洗涤沉淀离心弃乙醇干燥后溶于 缓冲液含 中 琼脂糖凝胶电泳检测 基因的扩增及克隆 根据 中已 经报道的假单胞菌属 基因的序列应用 软件设计一对特异性引物正向引物 反 向引物 以细菌基因组为模板进行扩 增预期扩增片段施氏假单胞菌基因以下 均简称 约为 反应条件 预变性 变性 退火 延 图 基因片段的 扩增 伸 个循环 延伸 保存 注 为 为 产物 为 产物经 琼脂糖凝胶电泳分离切下含 阴性对照 目的片段的胶条用胶回收试剂盒回收目的片段 基因序列分析 将测定的 下与 载体连接过夜构建重组质粒 的 碱基序列与已知序列进行比对 片 转化感受态大肠杆菌 涂布于 和 段中包含 的腺苷酸激酶基因并具有完整的 的氨苄青霉素琼脂平板上 倒置培养过夜 起始密码子为 终止密码子为 共 挑取白色单菌落经菌落 质粒提取以及质粒 编码 个氨基酸经 软件分析编码蛋白 鉴定为阳性的克隆子测定核苷酸序列 的分子量为 等电点 基因序列分析 据 核苷酸序列 与已知序列相比较 与施氏假单胞菌 利用 推导出氨基酸序列经 进 的同源性最高核苷酸序列只 行核苷酸氨基酸序列相似性比对确定基因的开放 有 个碱基差异导致 个氨基酸改变核苷酸同源 读码框 用瑞士生物信 性高达 息学研究所的蛋白分析系统 与假单胞菌属其他 蛋白相比同源性为 对目的基因进行生物信息学分析预测 图 结构域和 结 的理化性质应用 程序进行完全 构域是腺苷酸激酶中两个重要的功能区域在 比对以 软件选择 法分 结构域内施氏假