油茶SOD基因片段克隆及序列分析.pdfVIP

卷 期 草 业 科 学 油茶基因片段克隆及序列分析 郭春兰张 露 江西农业大学园林与艺术学院江西 南昌 摘要根据已报道的多种植物 和 基因的氨基酸序列的保守区域分别设计简并引物以油 茶 叶片总 为模板通过 分别扩增得到一个 的 基因片段和 一个 的 基因片段将片段序列在 网站上进行同源性比对表明本研究克隆的结果均 与多种植物的 和 基因存在亲缘关系因而认为所克隆的基因片段就是油茶 基因 并运用 软件分别进行序列分析推导的氨基酸序列分别为 个残基和 个残基具有所有植物 基因共有的保守区域与多种植物 基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分别在 和 以上与其他植物的 基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在 和 以上 关键词油茶 基因克隆序列分析 中图分类号 文献标识码 文章编号 超氧化物歧化酶 目标克隆其全长序列研究该基因时空特异性表 是一个金属酶家族具有清除生物体代谢所产生的 达为探索其调控途径奠定基础 超氧自由基的特异性能够有效防止生物分子被氧 材料与方法 化广泛存在于各种生物体内是生物执行体 材料 于 年 月从江西省林业科学院 防御机能最重要的酶之一 根据其酶活性 油茶种质资源圃采集油茶优良品种 赣无 号的 中心辅基结合金属离子的不同分为 幼嫩叶片用液氮速冻后放入 的超低温冰 和 自 世纪 年代从玉米 箱中备用 中克隆了首个植物 基因至今国内外 克隆载体 购自北京全式金生物公 学者已从莲 丹参 司受体大肠杆菌 菌株为 甘薯 莴苣 限制性内切酶 聚合酶等购自大连宝生物 等多种植物中克隆出 公司 产物纯化试剂盒购 自 公司 基因 氨苄青霉素 等购自上海生工 油茶 是山茶科山茶属植 生物工程有限公司 物为我国特有的食用油料树种其综合利用价值极 方法 高具有良好的生态经济和社会效益在我国林业 总 提取 使用改良异硫氰酸胍法提取 尤其是江西省林业中占有十分重要的地位 由 油茶叶片总 于油茶病虫害种类繁多主要有炭疽病软腐病烟 对试验所用的金属玻璃和塑料制品进行去 煤病油茶叶蜂油茶蛀茎虫等传统防治方法效果 酶 处理用 水浸泡枪头 不佳 而近年来油茶基因工程研究主要集中 和离心管 以上之后高温高压灭菌烘干后备 在与油脂合成有关的关键酶基因方面 与油茶 用金属和玻璃器具直接放入 烘箱内连续烘 抗逆分子研究的相关报道较少因此从分子水平 烤 以上提取 所用药品均为 专 对油茶的抗逆性进行研究具有重要的现实意义本 用取 叶片加液氮于研钵中研磨成粉末 研究以油茶为材料以克隆基因的核心序列为 将其转入已预冷的离心管中加入异硫氰酸 收稿日期 接受日期 基金项目国家科技部十一五科技支撑项目 作者简介郭春兰 女江西泰和人讲师在读博士生主要从事林木遗传育种研究 通信作者张露 胍提取缓冲液 巯基乙醇 可溶性 扩增 剧烈摇匀 按顺序依次加入 个循环后 保存扩增产物上述 醋酸钠 水饱和酚 氯仿异 产物经 的琼脂糖电泳后切下目的片段 戊醇 剧烈摇匀在冰上放置 经回收纯化后与 载体连接转化到 大肠杆 离心 转上清液至 菌中在 平板上进行蓝白斑 一新 离心管中加入等体积氯仿异戊醇 筛选然后随机挑选经 和 酶切确认 摇匀转上清液至一新管加入等体积异 的重组质粒送上海生工生物工程公司测序将测 丙醇 下放置 序结果在 网站上通过 和 进行 离心 去上清加入 异硫氰酸胍提取 序列的相似性分析用 生物软件进行序列 缓冲液和等体积异丙醇混匀 下放置 的比较分析 离心 去上清用 结果 乙醇洗 次沉淀把离心管置超净工作台上 总 完整性检测 用紫外分光光度法 适当晾干加适量 处理水溶解沉淀 电 测定油茶叶片总 的 和 泳紫外分光光度计检测分装于冰箱中保 比值其中 存 电泳检测结果显示 的亮度约为 简并引物设计 参照 所报道的番 的 倍图 说明提取的总 纯度 木瓜 杨树 高而且完整性好 柠檬棉花 等植物的 基因氨基酸的保守序列设计一对简并 引物 正 向引物 序 列 反向引物序列 参照 所报道的山茶烟草 洋橄 榄 拟南芥等植物的 基因氨基酸的保 守序列设计一对简并引物正向引物 序列 反 向引 物序 列 图 油茶叶片总 琼脂糖凝胶电泳检测图 所设计引物由 公司合成 总 反转录成 参照 公司的 逆转录试剂盒说明书合成第一链 注 改良异硫氰酸胍法 常规异硫氰酸胍法 油茶 和 基因片段 克隆 和 基因片段克隆 反应体系均为 包括 产物的分析 以 为模板和已报 道的多种植物的 基因序 正向引物 反向引物 列设计的简并引物经 扩增后分别得到一条 和 的特异性条带图 命名为 和 聚 经过双酶切鉴定后证明 和 均为 合酶 所要克隆的目的基因片段图 基因克隆的 反应程序为 扩增 序列分析和同源性比较 测序结果分析 序列