第二节聚合酶链式反应解析.ppt

Content of Table 一、PCR的定义 二、PCR技术的优点 三、PCR原理 四、PCR的标准反应体系 五、PCR反应五要素 六、PCR类型及应用 一、PCR的定义 在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。 二、PCR技术的优点 特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR product Target Amplification 四、PCR的标准反应体系 10×扩增缓冲液 10μl 4种dNTP混合物 各200μmol/L 引物 10～100 pmol 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 2.5 ul （Mg2+） 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至 100ul 五、PCR反应五要素 引物 （primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） 六、PCR的类型及应用 2、 PCR的应用 研究 -基因克隆、测序、分析突变 诊断 -细菌、病毒、寄生虫检测、诊断 人类基因组工程 -遗传图谱的构建、测序、表达图谱 法医 -犯罪现场标本分析 肿瘤检测 其他…… 法医学 个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。 什么是“DNA指纹技术”？ 世界上除同卵双生外，几乎没有指纹一模一样的两个人，所以指纹可以用来鉴别身份。 研究表明，每个人的DNA都不完全相同，因此，DNA也可以像指纹一样用来识别身份，科学家经过特殊处理后会显示某种“图案”，看上去好像黑白相间的条形码，这种方法就是DNA指纹技术。 * * 目录 * 目录 第二节 聚合酶链式反应Polymerase chain reactionPCR PCR技术的创建 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 Kary B. Mullis（1944－） 三、PCR原理 Sample 1. denaturatation 2. Primer annealing 3. Primer extension Region to be copied PCR技术原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链； 模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链； 重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。 PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形