第八小组电泳解析.ppt

electrophoresis 415宿舍 三，影 响 因 素 核 酸 电 泳 A 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ⑴设备与试剂： 水平型可制低浓度凝胶，且制胶与加样都较方便，故应用较广泛。 （2）制胶： 用缓冲液配制琼脂糖凝胶溶液，快速地彻底融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml，然后将其注入玻璃模子中，厚度依样品浓度而定。 注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。 ⑶样品制备与加样： 溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料（溴酚蓝或桔黄橙），也可使用2.5％Fico Ⅱ增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5-10μl ⑷电泳： 一般电压为5-15V/cm。对大分子可用电压5V/cm。最好在低温条件下进行。 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳. 　染色：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(10ng)时，需要脱色。 A 纸 电 泳 1)纸电泳 就是把样品以带状加在滤纸内来检测其移动和分离的方法。 常用以分离性质相似的物质，如各种氨基酸及稀土元素的分离等。 2)仪器装置 可分为低压电泳和高压电泳两类。 3)操作 　（1） 取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干备用。可按需要裁剪，并在距长度方向一端5～8cm处划一起始线，每隔2.5～3cm处做一记号备点样用。　 　　(2) 点样 有湿点法和干点法。 (4) 电泳 于电泳槽中加入适量枸橼酸盐缓冲液(pH3.0),浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为18～20V/cm，电泳约1小时45分钟，取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。 　　(5) 含量测定 剪下样品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条， 分别置试管中，各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml，摇匀， 放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或 离心法倾取上清液，按各药品项下的规定测定吸收度， 并按吸收系数计算含量。 * * 随着电泳技术不断发展和更新，其在临床医学和分子生物学领域中有着极其广泛的应用价值，相信随着该技术的不断发展必将越来越受到大家的青睐。 早期的电泳技术是由Svedberg教授提出的，1937年，ArneTiselius教授分离出了马血蛋白，开创了电泳技术的新纪元。 此后，各种电泳技术及仪器相继问世，使它在生物化学实验技术中占重要地位。 它主要用于分离各种有机物和无机盐；也可用于分析物质纯度，还可用于分子量的测定，可用于实验室生产，甚至于微生物和细胞的研究。 一， 概 念及原理 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。 电泳技术：依据分子或颗粒所带的电荷、形状和大小等不同，因而在电场介质中移动的速度不同，从而使其分离的技术 二， 分类 自由电泳 （缓冲液） Tisa-leas式 微量电泳 显微电泳 等电聚焦 电泳 等速电泳 密度梯度 电泳 区带电泳 （有支持体） 滤纸电泳 薄层电泳 垂直板.平板.柱\管状 凝胶电泳（琼脂、 聚丙烯酰胺凝胶） 补充 a等速电泳 加有领先离子和终末离子的样品，电泳后达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。 由于没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接的，且因“ 自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。 　　 b高效电泳色谱法 是将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体，在从凝胶中洗脱样品时，连续的洗脱液流载着分离好的成分，通过一个连机检测器，将结果显示并打印记录。 具有凝胶电泳固有的高分辨率，生物相容性的优点，又可方便地连续洗脱样品。 C毛细管电泳 即微柱胶电泳，是将毛细管浸入凝胶混合液中，然后将其揿入代用粘土封闭管底，用一支更细的毛细管吸水铺在凝胶上。聚合后，除去水层并加蛋白质溶液于凝胶上，毛细管的空隙用电极缓冲液注满，切除粘土部分即可。 1．电泳介质的pH值