基因工程第章目的基因的制备资料.ppt

第四章 目的基因的制备与分离 6学时 教学重点：基因组文库、cDNA文库及筛选文库方法的原理及操作规程。 第一节 目的基因的制备 第二节 目的基因的分离 第一节 目的基因的制备 一、直接分离法 1、限制性核酸内切酶酶切分离法 已知序列基因. 酶切后分离 与适当载体重组 转入受体。 2、物理化学法 密度梯度离心法：不同大小的DNA被分开，再用探针杂交检验。 单链酶解法：G C间三键，A T间双键，适当温度解开AT多的链，GC多的链未解开，用单链酶降解单链，剩下GC链。 分子杂交法：利用探针分子通过分子杂交固定相关基因。 是基因在发展初期所用的方法 3、双抗体免疫法 蛋白质已分离纯化，并制备了它的抗体1。 mRNA合成蛋白质时与核糖体蛋白质结合形成聚合体。 分离这种蛋白质聚合体，与制备好的抗体1进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免疫反应。 分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下mRNA，反转录后合成cDNA。 二 构建基因组文库 从生物组织细胞提取出全部DNA， 将DNA酶切成预期大小的片段， 将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞， 每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段, 许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体. 1、基因文库的概念 某种生物的基因组的遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组DNA文库（genomic DNA library） 2、基因文库的大小 一个理想的基因组文库应该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列。 DNA片段要有足够的长度，保证含有某个完整的基因序列。 估算：基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA片段的平均长度。 如：3×106 kb/15kb=2×105 经验值约比理论值大4.5倍。 基因组越大，包含的克隆数越多，反之越少。 3、构建λ噬菌体基因组文库的步骤 对DNA进行随机切割，以获得一定大小的含目的基因的DNA片段。 切割方法： 物理学方法：机械力和超声波。 生物化学法：酶切 为满足切割的随机性，一般采用识别序列为4bp的限制酶。 如Sau 3AI或Mbo I等切后的片段可直接与BamH I酶切的载体连接。 切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的DNA片段。 与λ噬菌体克隆载体连接重组。 噬菌体载体的酶切： 两臂与中央片段相连处有Sal I, Bam HI和Eco RI酶切位点。两臂中原有的酶切位点被除去。 采纳Bam HI，因为该酶切产生的粘性末端与Sau 3AI或Mbo I切割末端结构一样，采用Sau 3AI或Mbo I酶解产生的DNA片段可直接与噬菌体的Bam HI酶切位点连接。 Bam HI切割载体后，电泳或离心将两臂与中央片段分离，回收两臂。 在T4 DNA连接酶的作用下载体两臂与外源DNA片段连接。 重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒，转染宿主后铺板筛选培养，即可得到某种生物的基因组文库。 4、构建Cosmid质粒基因组文库 （1）、用Cosmid作载体构建基因组文库的优点： 可容纳更大片段（30-45kb），文库中所需克隆数少。 载体本身的分子很小，一般只有5kb，便于直接分析插入片段的酶切图谱。 （2）、缺点： 筛选困难：杂交检测难度大，携带外源片段大，复制困难，拷贝数少。 重组效率低：大片段易出现机械性断裂而不具备粘性末端。 文库不易贮存：噬菌体的重组DNA群体比含有Cosmid质粒的细菌菌落易贮存。 （3）、基因文库的构建过程 与噬菌体载体文库的过程大致相似，区别有 在外源DNA片段的分离要特别小心，防止断裂。 载体处理时只须酶切，不须进一步分离酶切产物，去除中央片段。但酶切后要用碱性磷酸酶去5`磷酸防止环化。 连接重组时，载体量高出外源片段的10倍，保证外源片段最在限度地与载体连接。 包装后的重组颗粒转染宿主时，在37度预吸附20min，加入1ml培养液，继续培养45min，再铺板，培养后出现的是菌落，不是噬菌斑。 5、构建YAC基因组文库 YAC：酵母人工染色体 适合克隆长达数百kb的大片段。 常用的YAC载体为pYAC4。 首先，用Bam HI Eco RI双酶切载体，形成双臂，回收两臂。 其次，制备生物完成DNA，用低浓度Eco RI部分消化，纯化后与YAC连接。 然后转化去壁的酵母细胞，并进行筛选。 三 、cDNA文库的构建及目的基因的分离 基因组很大，有重复序列和非编码序列。 通常表达基因占15%，产生约15000种mRNA。 从mRNA分离目的基因更容易。 可把mRNA反转录成cDNA，构建cDNA文库，从中分离目的基因。 1、cDNA基因文库的概念 （1）、某生物基因组转录mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这