基因芯片技术资料.ppt

* Solid support （载体）(glass玻璃, plastic塑料, metal金属, silicon硅) Miniaturized array of DNA (genetic material) （DNA微阵列） Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridization（分子杂交） Hybridized probes (DNA molecules) are fluorescently labeled（荧光标记探针） * Macroarray 膜阵列 dot 点 * * * 考虑荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应、介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。 * Lamp mask 膜 array阵列 * 设计方法取决于其应用目的，目前的应用范围主要包括基因表达和转录图谱分析急靶序列中单碱基多态位点或突变点的检测。表达型芯片的目的是在杂交实验中对多个不同状态样品（不同组织或不同发育阶段、不同药物刺激）中数千基因的表达差异进行定量检测，探针序列一般来自于已知基因的cDNA或EST库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合，对于同一目的的基因可设计多个序列不相重复的探针，使最终的数据更为可靠。 * 检测表达：mRNA提取，cDNA合成、PCR，标记 SNP或者突变检测、Genotyping:Genomic DNA纯化、标记 一旦生物样品被收集分离，它的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。因此，采样后需立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态。 将液氮或干冰带到采样现场，采样后立即抽提RNA或者运回实验室保存。 RNAlater RNA Stabilization Reagent, 只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂，RNA保护剂可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。37度1天；18~25度7天，2-8度4周，-20度永久保存。特别适用于动物组织（切成0.5cm),以使迅速渗透、培养细胞、细菌、白细胞，不适用全血或体液。 纯化柱 * 标记物要注意适用的芯片片基，如有的化学发光试剂盒不适用于玻片基质；间接荧光标记适用玻片基质 * * 配套商业化芯片有配套杂交试剂、杂交盒；自制芯片，可自行配，也可购买杂交buf,洗膜液，有不同严谨程度的杂交液可供选择。毕竟在芯片这样精密的实验中，在这么小的一个点上的DNA的两是非常有限的，要得到理想的结果需要非常精确的反应条件 * 得出待测样品的信息 * * 将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。 Cartesian - PixSys Series SpotBotTM 个人化全自动芯片点样仪 1. 待检测样品中mRNA 或DNA的提取及纯化 RNA的稳定性 液氮或干冰; 立即抽提 RNA 保护剂 纯化 2. RT-PCR或PCR扩增靶片段 固相PCR系统 3. 样品的标记 伴随RT or PCR过程 随机引物法、缺口平移法等 标记物 荧光染料，如Cy3、Cy5 生物素、地高辛 放射性核素，如 32P、33P 化学发光 金属离子Au和Ag(纳米金属微粒探针) 双/多色荧光标记 标记产物纯化 固 相 探 针 杂交 结果观察，信息分析 药物处理细 胞 总 mRNA Cy5 标记 未处理的细 胞总 mRNA Cy3 标记 cDNA 寡核苷酸 Cy3、Cy5双色荧光标记结果示意图 芯片杂交盒、洗片器；芯片杂交仪 杂交液 清洗液 影响杂交的因素 时间、温度、缓冲液等， 根据芯片上核酸片段的长短、用途选择 杂交条件 1、预制的基因芯片 2、芯片滚动杂交仪 3、全自动芯片 洗涤工作站 4、芯片扫描仪 5、分析系统 1 2 3 4 5 基因表达检测 高盐、高样品浓度、低温、长时间（过夜），严谨性较低，有利于增加低拷贝基因检测的灵敏度。 基因突变检测 低盐、高温、短时间（几小时），严谨性高，有利于鉴别出单碱基错配。 磷感屏成像系统 荧光芯片扫描仪 图像分析和数据处理软件 基于光电倍增馆（PMT）的检测系统 CCD摄