黄病毒在蚊子中的研究课件.pptVIP

果蝇hig是一种分泌型蛋白，特异的表达在神经系统中。 左下图显微注射：随后想看看denv的感染能否影响aahig表达。 * 与果蝇的hig不同 序列预测表明aahig缺少N端信号肽。为了看是否可以分泌，克隆全长的aahig 到表达载体后转染到果蝇s2细胞中。 表明aahig能够分泌并富集在质膜上。 E：为了确定aahig在中枢神经系统的精确定位，对蚊子大脑染色。Aahig分布在蚊子大脑的触角及视叶，并且富集在神经细胞表面。 * 为了表明aahig亚细胞定位，收集了雌性埃及伊蚊的大脑组织，分离出了核，线粒体 细胞质及质膜。特异染色表明aahig位于质膜部分。 * 作者重复了以前的文章中的dsrna介导的aahig沉默从而增强denv2 yfv的载量，胸腔注射aahig dsrna显著降低其表达。沉默3天后胸腔显微注射denv2。 为了排除dsrna介导 的rna干扰的脱靶效应以及后续确立aahig在黄病毒感染中的作用，作者通过胸腔接种aahig抗体来免疫封闭天然的aahig来进行功能研究。 为了评价抗体是否可以通过循环系统递送到蚊子大脑中，作者接种稀释过的鼠抗aahig抗体到蚊子胸腔，随后检测在蚊子大脑中的分布。右上：可见鼠抗aahig抗体分布在神经细胞表面。 右下：分布在接种蚊子的大脑 * 上i：一系列稀释的抗体与denv2预混 之后显微注射，aahig中和显著增强denv2感染性。上ii：因为之前结果表明aahig主要分布在中枢神经系统，所以检测大脑中的病毒量 左下：通过口服感染病毒，aahig封闭后也显著增加denv2载量。 先前研究表明aahig抗体不会结合到denv2 表面E蛋白及粒子上，说明蚊子头部病毒载量增加不是被aahig抗体非特异性识别的结果。 作者发现唾液腺及中肠的病毒载量并不会收到aahig抗体接种的影响。表明aahig是一种神经细胞特异性的能有效控制病毒在神经系统中复制，而外周组织不行。 * 作者研究aahig在jev感染中的作用，用埃及伊蚊作为模型。 * 作者后来检测了hig同源物对于jev感染其自然载体库蚊中的作用。同样进行dsrna沉默。 左：沉默3天后显微注射jev。 右：而且当接种aahig抗体后，其也能与cphig反应，显著增加jev量。表明hig蛋白在蚊子中的功能是保守的。 * 为了检测aahig的抗病毒活性是否也可以扩展到其他蚊媒病毒，作者选择辛德毕斯病毒，它是甲病毒属中的一种。最早从库蚊中分离，但在广泛的蚊子种类中都可作为其载体在自然界传播。 因此埃及伊蚊胸腔注射aahig dsrna。然而沉默后不影响sinv载量。 随后实验表明aahig不会与sinv E1 E2 E3相作用，表明了aahig黄病毒特异的抗病毒作用。 * 蚊子的寿命很少会因持续黄病毒感染而降低。蚊子中的抗病毒因素不能根除病毒但可以限制病毒量在可以容忍的水平而不产生严重组织损伤。先前研究表明虫媒感染导致蚊子组织的凋亡。 因此作者想看看在aahig抗体作用下denv2感染的蚊子大脑中的凋亡。A：tunel染色 B :细胞凋亡蛋白酶 随后作者想看看免疫封闭aabig后感染deng2或jev后的存活率。 病毒预混稀释的ahhig抗体后显微注射。表明在持续的黄病毒感染中aahig是蚊子存活的一个关键的因素。 * Ccp结构域的功能是作为病毒识别的组件。接下来作者想看看aahig是否也具有同样的策略调控病毒感染。 全长的aahig在果蝇s2细胞表达系统中表达及纯化。B:能够与denv2 E蛋白产生强作用。C:并且有效捕获denv2粒子。D: 并且能在蚊子aag2细胞中被大量表达的aahig蛋白pulldown下来。 E：denv跟aahig共染色也表明位于神经细胞表面。 右AB：aahig与jev相互作用也通过ELISA跟coip验证。 登革 E蛋白全长约500个aa。其中N端400个aa形成胞外域。胞外域由3个结构域组成，分别称为包膜蛋白结构域1 2 3. ED1(1-52AA; 133AA-193AA; 281-296AA) 和ED2 (53-132AA; 194-280AA)都是结构结构域，ED1和ED2的线性基序是交错的。而ED3的结构域有一个完全线性序列组成(297AA-400AA)。 基于以上已经知道些信息，作者构建的ED1+ED2以及ED3在果蝇S2细胞中表达。 * G H:可见aahig能够与ed1+ed2反映不与ed3反应。 I:为了进一步研究ED1和ED2的结合基序，构建了5个截短的蛋白。结果表明在ED2中53-132位aa对于与aahig作用是必不可少的。 后续分析53-132aa发现该基序在denv jev yfv的E蛋白中相同度在46%-75%。计算结构模型表明其在三种黄病毒中是保守的。 J:为了研究