第五章核酸序列分析讲解.ppt

contents 1. 核酸序列检索 2. 分子质量、碱基组成、碱基分布、序列转换、核酸序列基本分析 3. 限制性酶切分析 4. 克隆测序分析 5. 测序中载体序列的识别与去除 6. 核酸序列拼接 7. 核酸序列的电子延伸 8. 开放阅读框（ORF）分析 9. 基因组序列编码区/内含子结构分析 10. CpG岛分析 11. cDNA和Genomic DNA比对 12. 基因启动子分析 ？设计一个实验，研究在不同浓度NaCl盐胁迫下玉米根中SOD 2 （Superoxide Dismutase 2）基因的表达情况，说出具体的实施方案。 （玉米SOD2基因序列已知，手头有玉米的种子） 1. 克隆测序分析 测序峰图查看 为了核实测序的准确性，往往需要对测序峰文件进行直接分析。Windows环境下最简单的峰图查看程序是澳大利亚的Chromas.exe程序，这是一个专业程序，运行快、操作简单。 其它的软件还有BioEdit和DNAMAN等也都具有该功能。 DNAMAN查看测序峰图 2. 测序中载体序列的识别与去除 3. 核酸序列拼接 4. 分子质量、碱基组成、碱基分布、序列转换酸序列基本分析 核酸序列的分子质量、碱基组成、碱基分布等分析可以通过一些常用软件如：DNAMAN、Genetool、DNAStar等进行。下面我们以小鼠SOD1基因为例，利用DNAMAN软件进行上述分析。 得到的结果 ？设计一个实验，通过什么样的方法获得家蚕性信息素结合蛋白（CSP1）在家蚕不同组织（头、胸、腹、触角、翅、足）中的表达谱，说出具体的实施方案。 （家蚕CSP1基因可以查到，手头上有家蚕的个体） 5. 限制性酶切分析 以DNAMAN为例 2.以BioEdit软件为例 ？对于基因组未进行测序的物种，只知道某一基因的partial CDS区，如何获得其全长cDNA序列？ 6. 核酸序列的电子延伸 通过RACE实验能有效解决全长cDNA问题,但此实验操作要求高，具有耗时、耗财、耗力等缺点。 电子克隆 基本过程 将待分析核酸序列（或蛋白序列，称为种子序列）用blast软件搜索GenBank的EST数据库，选择与之具有较高一致性的EST序列（称匹配序列）。 将匹配序列与种子序列装配产生新生序列，此过程称为片断重叠群分析（Contig Analysis）。（如果种子序列不是核酸，则不必拼装新序列） 以新生序列作为种子序列重复上述过程，直至没有新的匹配序列入选，从而生成最后的新生序列，作为对种子序列的延伸产物。 对延伸产物进行ORF分析，确定cDNA的完整性。 例：以拟南芥（Arabidopsis thaliana）Cu-ZnSOD的蛋白质序列（P24704）为种子序列，电子克隆水稻（rice）的Cu-ZnSOD基因的过程。 CAP：contig assembly program 提交后的结果 如果提交的序列超过50kb，则无法拼装，需减少序列 7. 开放阅读框（ORF）分析 mRNA序列需要翻译为蛋白质才能发挥其生物学作用，因此核酸序列的可读框架（Open Reading Frame，ORF）分析也是核酸序列分析一个重要方面。对真核生物而言，一条全长cDNA序列将只含有单一的开放阅读框。非全长cDNA序列如ESTs，通过所有位相搜索也可很快获得结果。GenBank的ORF Finder是一个较好的ORF分析网络资源。 地址：/gorf/gorf.html 可以在NCBI首页的右边一栏中直接点击ORF Finder链接进入ORF分析页面。 (1) NCBI ORF Finder在线确定ORF Kozak规则 所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下： (1) 第4位的偏好碱基为G； (2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 Kozak规则是基于已知数据的统计结果，不见得必须全部满足，一般来说，满足前两项即可。 (2) 本地化软件进行ORF分析 8. 基因组序列编码区/内含子结构分析 真核生物的基因组中内含子的分析：真核生物基因组的分析比较麻烦，难于准确判断内含子和外显子区域，也即难于准确地对编码区域进行预测。进行基因组序列编码器/内含子结果分析的软件，如GENSCAN（/GENSCAN.html）等。 tRNA内含子的分析：可以用tRNAscan-SE分析（/tRNAscan-SE/） GENSCAN：现有的服务器设在MIT，主要应用于完整基因的预测，包括基因组序列中的外显子、内含子、启动子、多聚腺苷酸信号