聚丙烯酰胺凝胶电泳原理步骤详细讲解.ppt

上海交通大学医学院 Load a sample into a polyacrylamide gel electrophoresis well 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 讲课内容 PAG的组成 1 PAG的聚合 2 PAG的浓度与孔径的关系 3 不连续PAGE 4 PAGE的特点 5 上海交通大学医学院 五、PAGE 的 特 点 1.具有分子筛效应，分辨率高 2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g 3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团 4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象 5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明 6.网孔可调节 上海交通大学医学院 小 结 1.掌握（不连续）PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合 上海交通大学医学院 思 考 题 名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 * * * * * * * * * * * * 上海交通大学医学院 / 李莉 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE 上海交通大学医学院 小 结 1.掌握（不连续）PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合 上海交通大学医学院 思 考 题 名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 上海交通大学医学院 讲课内容 PAG的组成 1 PAG的聚合 2 PAG的浓度与孔径的关系 3 不连续PAGE 4 PAGE的特点 5 上海交通大学医学院 一、PAG 的 组成 PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）交联剂通过自由基（ free radicals）聚合而成的一种多孔三维网状结构。 Acr + Bis? porous matrix 上海交通大学医学院 （1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式 上海交通大学医学院 （2）亚甲双丙烯酰胺 （N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis） 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 讲课内容 PAG的组成 1 PAG的聚合 2 PAG的浓度与孔径的关系 3 不连续PAGE 4 PAGE的特点 5 上海交通大学医学院 二、PAG的聚合 polymerization of PAG 需要催化剂(catalyzer)——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基(Free radicals )，从而与Bis进行聚合 上海交通大学医学院 （一）化学聚合：AP-TEMED系统 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（-N,N,N,N-tetramethylethylene diamine , TEMED）为加速剂。 上海交通大学医学院 AP在水溶液中能产生游离基SO42-.，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶 TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-. 注意： ?TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 ?分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 ?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合 上海交通大学医学院 （二）光聚合：核黄素-TEMED系统 有痕迹氧存在下，核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意： 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。 上海交通大学医学院 讲课内容 PAG的组成 1 PAG的聚合 2 PAG的浓度与孔径的关系 3