分子杂交精要.pptVIP

The Klenow fragment 去除了E. coli DNA polymerase I 的5’→3’的外切酶活性，具有5’→3’的聚合酶活性及3’ →5’ 外切酶活性。在pH 6.6的条件下，3’ →5’ 外切酶活性被大大降低（有的公司提供无该酶活性的酶） 随机Primer：可通过用DNase I 消化牛胸腺DNA、DNA合成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针DNA的平均长度与引物的浓度成反比[=k/(lnPc)1/2, Pc 是引物的浓度]，一般可产生~400-600 bp 的标记产物。 随机引物标记体系 模板DNA：一般为线状双链DNA α-32P-d CTP： (放射性比活3000Ci/mmol)?，半衰期14.3天，最大能量1.71 Mev，最大辐射范围：空气中610cm，水中0.8cm，有机玻璃中0.76cm。 或DIG-11-dUTP标记： * * 1 × 5× DNA 7 ?l HindIII (10U/μl) 1 ?l 5 ?l 10×buffer 2 ?l 10?l ddH2O 10 ?l 50?l Total 20 ?l 37°C 酶切过夜 本实验酶切体系 混匀分装 电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测。 若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则重做 。 出现切烂：DNA降解，重新提DNA； 切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化。? 酶切效果检测 A1优总DNA A2劣总DNA B1 酶切烂 B2酶切优 B3切不动 总DNA酶切电泳检测 12 1 2 3 4 5 6 7 9 (kb) 1 2 3 35 显影后的杂交结果 酶切反应的终止 加入终浓度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应 多数酶在65°C 10分钟可被不可逆灭活，少数65°C不失活的酶在75 °C 15分钟也能失活 若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化 造成DNA酶切不完全的主要原因 DNA问题：不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；被甲基化；酶切后DNA粘末端退火；识别位点的两侧插入了影响酶切效率的序列； 操作不当：酶或DNA粘在管壁上，反应体系没完全混合；酶粘度大，取样不准或酶稀释不正确； 反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适; 酶的问题：活力不够；强烈振荡使酶变性；过度稀释使酶活性降低等。 DNA样品中抑制酶活的主要污染物 DNA 样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性。 解决办法： 增加酶作用的单位数（10-20U/μg DNA)； 增大反应体积以稀释可能的抑制剂； 延长反应时间； 消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物； 纯化DNA。 胶浓度0.7-0.8%。 胶厚度 5mm (250ml胶)，用1倍TAE配制。 胶的均一性(不同样品的迁移率一致)。 样品DNA量 指示剂量稍大，长时间指示。 点样顺序：marker，阳性对照，阴性对照，本组样品 电泳电压：大电泳槽40V，12小时，1-1.5V/cm。 电泳结束，指示剂约移动10-11cm。 电泳 转膜的方式： 1. Upward Capillary Transfer (Figure 1) 2. Downward Capillary Transfer (Figure 2) 3. Simultaneous Transfer to Two Membranes 4. Electrophoretic Transfer 5. Vacuum Transfer 转膜 Upward Capillary Transfer Downward Capillary Transfer 尼龙膜：高强度，不易破损，与DNA共价结合，反复使用10次以上不破损，不丢失DNA，吸附DNA每cm2比硝酸膜多5倍，50bp有效杂交。 硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失DNA，500bp的DNA