目的基因表达解读.ppt

* 思考题：加入培养基的乳糖是如何运输进入细胞内？ * * * lacIq ：表达的阻遏蛋白量更多造成和lacO更容易结合。 * 包涵体缺点：复性费用高，复性方法不具有普适性。 * 基本结构细胞内有小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spliceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。 * 细胞内有小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。 * 内源启动子缺点较多：特别是容易干扰其他基因的表达。如热诱导启动子天然控制的一些基因的表达。 * 必须维持阻遏蛋白的高表达以降低本底或泄漏水平，但高浓度阻遏蛋白对宿主的毒性也大 * 融合蛋白：单纯疱疹病毒(hsv)VP16反式激活蛋白 ＋ 阻遏蛋白 * 真核细胞的基本转录因子具有很强的保守性 * ＧＰＩ锚定蛋白是一类通过其羧基末端的糖基化磷脂酰结构锚定于真核细胞表面的蛋白。在哺乳动物细胞中， ＧＰＩ锚定蛋白主要锚定于细胞膜的表面， 定位于胞外侧， 形成细胞膜 ＧＰＩ锚定蛋白,而 在酵母菌等真菌细胞中， 由于有细胞壁的存在， ＧＰＩ锚定蛋白除了可以锚定于细胞膜表面外， 其中部分蛋白可从膜上脱落， 而以共价键的形式与细胞壁上的β １， ６ 葡聚糖相结合， 形成细胞壁 ＧＰＩ锚定蛋白酵母细胞壁重量达细胞干重的 ２ ５ ％， 呈三明治状， 外层为甘露聚糖 ，内层为葡聚糖， 都是分枝状聚合物， 中间夹着一层蛋白质（ 包括葡聚糖酶、 甘露聚糖酶等多种酶） 。外层甘露聚糖共价连接到内层葡聚糖上。葡聚糖维持细胞壁的强度， 甘露聚糖决定细胞表面特性。在单倍体细胞融合形成二倍体的过程中， α－交配型（ ＭＡＴ α ） 细胞表达的 α－凝集素（ 甘露糖蛋白） 可与 ａ－交配型细胞表达的ａ －凝集素相互作用， 介导细胞融合。在酵母絮凝过程中， 絮凝基因编码的絮凝蛋白 与邻近细胞壁的甘露聚糖结合， 致使多细胞聚集. 5‘端甲基化的帽子为核糖体结合位点，和其40S亚基发生作用， 40S亚基结合后沿链滑动到AUG处，此时核糖体组装完整（加上60S亚基），开始翻译。 除此之外，一些mRNA（真核病毒和少数真核基因）在起始密码子上游还有IRES位点（ internal ribosome entry sites，内部核糖体进入位点） 。这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合（40S亚基P位点，起始蛋白质翻译） 不同于原核生物的SD序列，IRES序列长度变化很大，从9bp到数百bp长，IRES的存在可以很方便的构建人工的真核操纵子，不同翻译强度的IRES序列，也为不同基因的表达协调提供了可选的元件。 如果第一个ATG周围的序列符合KOZAK序列（NNNPuNNATGG),小亚基将会在此驻留较长的时间，从而更有利于组装成完整的核糖体，使翻译效率提高 ★ KOZAK是一个女科学家，她总结出在真核生物中起始密码子两端序列为： G/N-C/N-C/N-ANNAUGG，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG时，翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。 Kozak序列为统计规律，第4位的偏好碱基为G，AUG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T。　　　　 真核基因表达时通常在AUG前需设计GCCACC 的kozak序列，或使用基因上游序列自带的kozak序列，避免核糖体出现leaky scan KOZAK序列 NNNPuNNATGG ★ 4.2真核诱导表达体系 对于组成型表达系统，常用来源于病毒的启动子和增强子，或者看家基因的启动子（如gapA/GAPDH的启动子） 如SV40病毒早期启动子和增强子、Rouse肉瘤病毒基因组长末端重复序列—LTR(RSV)、人类巨细胞病毒等(CMV)。 poly(A)加尾信号：AAUAAA 真核表达载体含有两类组件：原核生物中使用的组件(包括复制子、抗性筛选基因和多克隆位点等)和真核宿主细胞中表达所需的转录调控元件（启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号(内含子两侧)序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列以及药物抗性基因等） 无诱导物存在时表达水平低:既本底表达水平低或无泄漏 诱导物存在时表达水平很高，且表达水平易受诱导物控制 启动子系统不干扰宿主细胞的正常生理活动,系统不影响宿主中其它基因的表达，不易引起免疫识别 诱导物易进入细胞，半衰期短，不易在体内残留 理想诱导表达系统的特点 内源诱导启动子