目的基因的获得解读.ppt

第三节 目的基因的获得 基因组文库法 cDNA文库法 PCR法 化学合成法 一、基因组文库法 把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。 载体与基因组DNA大片段的连接 从基因库中筛选目的基因 利用探针筛选 利用目的基因的翻译产物筛选 二、cDNA文库法 cDNA文库的定义： 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库。 三、PCR法 四、化学合成法 合成基因（基因较小） 合成引物 合成探针 第四节 基因工程的操作过程 为何要用双酶切？ 防止目的基因自连和载体自连 控制目的基因的连接方向 3、TA克隆 一般情况下，Taq DNA 聚合酶同时具有的末端转移酶的功能，在PCR反应时会在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个A，这样的PCR产物可以直接与T-载体连接。 三、重组DNA导入受体细胞 电转化法 四、克隆子的筛选与鉴定 根据载体标记筛选 抗生素抗性标记筛选（pBR322） 根据LacZ’基因互补显色筛选 根据载体除草剂抗性基因筛选（植物细胞） 根据宿主基因缺陷互补进行筛选 根据报告基因筛选 （二）克隆子的鉴定 DNA水平 转录水平 翻译水平 1、DNA水平 2、转录水平 Northern blot RT-PCR Northern blotting （2） ELISA检测的一般步骤 B 一抗结合 C 二抗结合 D 显色反应 E 比色 2）免疫印迹（western blot）法 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： ③蛋白质电泳的分子量标准 ④凝胶中的蛋白质染色： 银染 用放射性同位素或非放射性标记物标记特异性抗体。 将转膜的印迹上的抗原与抗体反应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，则表明受体细胞中存在目的基因表达产物。 Blotting Blotting过程 ④结果 （2） Western转膜装置 （3）免疫印迹检测 2、原生质体融合 通过带有外源DNA的细菌原生质体同培养的动物细胞直接融合。经过细胞膜融合，细菌内容物能转入动物细胞中，DNA被转移到细胞核中。 3、脂质体法 脂质体是由磷脂双分子层组成的人工膜状结构，将DNA包裹于脂质体微囊中，并通过脂质体与原生质体的融合或原生质体的吞噬过程，将外源DNA导入。 脂质体 4、体内注射转化法 　利用显微注射仪把外源DNA直接注入细胞的转基因方法，可用于动植物的外源DNA的转化。本方法操作繁琐，但转化效率较高。 (一) 克隆子的筛选 通常将摄取外源DNA分子并在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子 根据载体标记基因筛选 根据报告基因筛选 绿色荧光蛋白（GFP）与外源基因共表达 （1）酶切鉴定 克隆子质粒提取 酶 切 电 泳 质粒片段 外源基因 (2) PCR鉴定 克隆子质粒提取 以质粒为模版进行PCR 电泳分析 引物按照外源基因序列或质粒序列设计 （3）Southern 印记杂交 ——Southern blot 菌落原位杂交 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。 主要检测插入片断是否被转录。 从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。 3、翻译水平 1）酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay （1） 原理： 一抗：与目标分子的特异结合。 二抗：与一抗的特异性结合。 酶连：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 A 固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 孔底 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。 二抗 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 1. 原理： 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质变成棒状分子，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。 ① SDS: （SDS）： （Polyacrylamide gel electrophoresis） 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大