牙周病基础治疗后龈下菌群动态观察.pdfVIP

中文摘要 厂目 的 rDNA片段， 本实验设计通用引物扩增龈下菌斑全细菌16S 通过变性梯度凝胶电泳得到龈下菌群DNA图谱，动态观察龈下细 菌治疗前后在口腔内定植的变化，为牙周病病因学的研究和临床 治疗方案的确定提供实验依据。 方 法 1．标本选择：龈下菌斑取自中国医科大学口腔医学院牙周病 门诊成人牙周炎患者。实验对象选择年龄在30—55周岁之间、探 诊深度3—6毫米、无全身系统疾病、未接受过牙周治疗、近两个月 未服用任何抗生素和甾体类药物者，共26例。 2．治疗随访计划：患者首次就诊，以治疗前牙周状态为基 On 数(BleedingProbing，BOP)、牙齿松动度和牙槽骨吸收度，测 量探诊深度(ProbingDepth，PD)；进行全口龈上洁治、龈下刮治、 根面平整，嘱患者口服甲硝唑(200rag，liD)7天。治疗后一周、 一个月和三个月时复查，取龈下菌斑，记录牙周临床指标。 3．标本采集：刮匙法。每个实验对象选取探诊深度在3— 6mm之间的一颗牙齿作为研究对象，龈下刮治器刮取牙周袋的近 中、远中、颊侧牙根面和软组织面各一下，置入含0．5ml无菌PBS 溶液的Eppendorf管中，一70℃深冻冰箱保存。 4．统计学分析：应用SPSSll．0软件分析牙周临床指标在治 疗前后是否有差异及相关性。 5．龈下菌斑DNA的提取及浓度测定：酚一氯仿法提取龈下 菌斑全细菌DNA，溶于60心TE。取5出测量DNA纯度及浓度， 其余置一20％冰箱保存。紫外分光光度仪分别测量260nm和 280nm处吸光度值及比值。比值界于1．7—2．0之间，表示DNA 纯度较好。按公式：DNA浓度(斗g／出)=(AⅫX50×稀释倍数)／ 1000，对DNA进行定量分析。 rDNA序 6．PCR扩增：16SrDNA通用引物扩增全细菌16S 列。设计含GC夹的引物，使扩增后的PCR产物在浓度递增的变 性梯度凝跤中始终保持分叉状结构。1％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。 7．变性梯度凝胶电泳(DGGE)观察龈下菌群DNA图谱。 7．1垂直DGC-E：制备0～100％垂直变性梯度凝胶，检测最 适解链条件(即变性浓度)。 7．2平行DGGE：根据垂直DGGE检测到的解链区域变性浓 度，制备相应变性范围的平行梯度凝胶。动态观察治疗前后龈下 菌群DNA图谱。 7．3选择特异条带进行切胶、测序分析：选择治疗后减弱、消 失的两个DNA条带和治疗后新出现的两个条带，切胶、回收、克 隆、纯化、测序。 结 果 1．牙周基础治疗前后临床指标的变化 1．1 26例成人牙周炎患者经牙周基础治疗后，临床症状明 显改善，牙周临床指标均有下降。统计学分析表明PII、BOP、PD 和牙齿松动度在治疗前后具有明显差异(P0．01)。牙槽骨吸收 度在治疗前后变化不明显，无统计学意义。龈下全细菌DNA浓度 有下降趋势，这种差异不具有统计学意义。 1．2 Spearman相关分析表明BOP与PD具有重度正相关关 ·2· 动度与牙槽骨吸收度和PD呈中重度正相关关系(r=0．630、0． 526，P0．01)，随着牙槽骨吸收度和PD的减少，牙齿松动度降 低。 一 2．DGGE图像分析 变性梯度凝胶电泳成功地得到龈下菌群DNA图谱，可动态观 察龈下菌群在基础治疗前后的变化：治疗后一个月DNA图谱变 化明显，新带出现；治疗后三个月与治疗前在一定程度上相似。 3．测序结果 选取治疗前明显、治疗后减弱、消失的两个DNA条带，切胶、 回收、克隆、纯化、测序。测序结果经GenBank的BLAST分析，表 明它们的碱基序列与牙龈卟啉单胞菌(Porphyromona