阿仑磷酸盐诱导骨细胞凋亡的实验研究.pdfVIP

中文摘要 阿仑磷酸盐诱导破骨细胞凋亡的实验研究 摘 要 目的：在成功的建立体外大鼠破骨细胞培养系的基础 上观察不同浓度的阿仑磷酸盐在体外实验中诱导破骨细 胞凋亡的情况，并通过体内实验加以论证。 f方法：实验分两组：体外实验组(细胞培养组)：体内 实验组(动物实验组)。 体外实验。全骨髓细胞的提取及培养：将4周龄雄性 SD大鼠乙醚麻醉，断颈处死。无菌条件下取股骨和胫骨， 去净骨表面的软组织，剪断长骨两骺端，暴露骨髓腔，用 10ml一次性注射器吸取10mlQ-MEM插入髓腔冲洗，至 骨发白。收集细胞悬液，然后以1500转／分钟离心4分钟， 弃去上清液，再加入40mlQ-MEM吹打均匀后进行二次 离心。这样洗涤细胞两次后，加入20mlQ．MEM全培养 液(体积分数15％新生牛血清，青霉素1000l-t／ml，链霉 素1000u x106cell／ml的细 g／m1)，计算细胞数，配成2 胞悬液，注入24孔培养板0．5ml／孔和50ml培养瓶10ml／ 瓶，同时加入l，25(OH)2D3使其终浓度为10一mol／l，然后 37℃孵育箱中培养。每3天更换一次培养液， 放入5％C02 去掉3／5体积的旧培养液，换以同体积的含1,25(OH)2D3 新培养液。培养至第六天时，经倒置相差显微镜和TRAP 特异染色证实所培养的细胞为破骨细胞。 培养板组和对照组：培养至第6天，加入ALN，使其 终浓度为10一，10～，10一，10巧M，对照组给予同体积的 中文摘要 磷酸缓冲液(PBS)，继续培养48小时。然后，平板离心 4分钟，1500转／分钟，TRAP染色，镜下计数每孔的破骨 细胞数目。再滴加Hoechest33258染液，浓度为5u∥m1， 室温下避光放置15分钟，PBS缓冲液冲洗干净，并用滤 纸吸干液体，倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态和数 目。 培养瓶组和对照组：同上，培养至第6天时，加入同 板中浓度一致的ALN和同体积的PBS缓冲液，培养48 小时后，细胞刷轻刮瓶壁，洗涤两次，送流式细胞仪检测。 用Annexin．V和PI结合检测凋亡的破骨细胞数目。 体内实验。给药：将3只大鼠随机分成用药组(8根 骨)和阴性对照组(4根骨)，按2mg／kg剂量腹腔内注射 ALN和PBS连续2日。 灌流固定及取骨：最后一次给药24小时后，2％戊巴 3-5分钟后， 比妥钠腹腔内注射，每只鼠注射0．4．0．6ml， 待大鼠全身瘫软，进入麻醉状态，将其四肢固定，剪开胸 部皮肤及皮下组织，暴露心脏，用12号针从左心室直插 入主动脉，同时剪开左心耳，进行心脏灌流。先以PBS 液将全身的血液冲出，然后注入固定液(1．25％戊二醛，4％ 多聚甲醛，0．1MPBS液)，待大鼠全身僵直后，停止灌流。 按体外实验的方法取其股骨和胫骨，然后放入固定液中， 浸润固定2．3小时。 脱钙：将固定好的骨标本用0．1MPBS液冲洗干净，放 入PBS液中4C冰箱过夜。第二日，将骨标本放入PH=7．4 acetic 的5％EDTA(ethylenediaminotetraacid)中脱钙2周， 隔日换液一次。 中文摘要 制作骨切片：将脱好钙的骨标本常规梯度脱水，二甲 苯透明，浸蜡，包埋，然后将蜡块切成5p．m厚的组织切 片备用。 TRAP染色：石蜡切片常规脱蜡至水。在常温下，将 配好的TRAP染色液滴于切片上，每张3滴左右，然后放 37℃孵育箱孵育，30分钟后取出，用蒸馏水冲 入5％C02 洗干净。 苏木素复染：将TRAP染好的切片放入苏木素中5分 钟，盐酸．酒精分化后，二次脱水，二甲苯透明，树胶封 片。 结果：l、体外实验结果。TRAP染色结果：培养第 六天TRAP染色，胞浆呈紫红色且伸出许多细长的伪足样 突起，细胞核多者为破骨细胞。加药后，对照组的阳性细 胞数目明显多于用药组，且胞浆丰满，内含许多空泡