第四章动物细胞工程制药要点.pptVIP

第四节　转基因动物 一、转基因动物的产生和发展 转基因动物(transgenic animal）:通过基因工程技术将外源DNA导入动物生殖细胞，干细胞，早期胚胎，并在受体动物染色体上稳定整合，并能够稳定传给子代的技术，称为转基因技术。通过转基因技术所获得的动物称转基因动物。 转基因动物 20世纪70年代中期，基因重组技术与细胞工程技术结合，产生了转基因动物和转基因植物。 1974年,HJaenisch和MinZe首次报道向小鼠囊胚注射SV40 DNA后，生产的小鼠部分组织中检测到了SV40 rDNA序列。 1980年,Gordon等人通过向小鼠的单细胞胚胎原核注射纯化的DNA---人胸苷激酶基因，获得转基因小鼠。这是一只得真正意义的第一只转基因动物。 转基因硕鼠 1982年Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中,获得比普通小鼠生长速度快2~4倍，震惊了世界。 生物反应器研发 在此后几年中，以改进经济性状为目的的转基因动物研究成为热点课题。 但除转基因鱼外，多数转基因动物并没有达到预想的要求。 Gordon于1987年获得了分泌组织纤溶酶原激活因子tPA的转基因小鼠。以后的数年内，转基因羊、猪、牛的乳腺生物反应器便相继问世，利用此生产出了多种生物药物：凝血因子Ⅸ、凝血因子XIII、抗胰蛋白酶、tPA、红细胞生成素（EPO）等。 动物克隆技术、干细胞技术等与转基因动物技术相结合，加快了动物生物反应器的研究与应用进程。 美国麻省生物技术公司（GTC，Biotherapeutics）利用转基因动物技术开发、生产和商业化治疗用蛋白质。ATryn是GTC生物治疗公司开发的一种人抗凝血酶重组蛋白，它是第一个在世界上得到认可的转基因动物生产的蛋白。 2006年6月宣布，美国GTC公司用转基因山羊生产的人抗凝血酶“ATryn”（α-antithrombin）获得欧洲药品评价局（EMEA）人用药品委员会（CHMP）的批准推荐。 2009年2月，FDA首次批准由转基因动物生产药物-人抗凝血酶“ATryn”上市。 二、转基因动物技术的原理和方法 （一）基本原理 体外构建的重组DNA分子通过显微注射，病毒载体转移，胚胎干细胞转染等方法注入动物的受精卵或床前的胚胎细胞，然后将此受精卵或胚胎细胞植入子宫，使其发育成携带外源基因的转基因动物 （二）外源目的基因转入动物的早期胚胎方法 1.显微注射法 在光学显微镜下，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。 2.反转录病毒感染法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的）获得转基因动物的方法． 在培育转基因禽类研究中有广泛应用，是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法，主要集中在鸡的良种培育及抗病毒感染研究方面。 （1）反转录病毒基因 （3）包装细胞 在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒； 病毒包装细胞：染色体整合除序列的整个病毒基因组，为重组蛋白载体转录的RNA提供包装蛋白 病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。 （4）通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 利用反转录病毒DNA的LTR区域具有转录启动子的特点，外源基因随病毒RNA转录，并在载体上 序列的作用下，重组病毒转录的RNA和包装细胞提供的包装蛋白就可以组装成有感染性的病毒颗粒 病毒收获后感染早期胚胎或直接感染受精卵。 或构建好的DNA注射入囊胚腔中和重组病毒及辅助病毒共培养进行转染 3.胚胎干细胞方法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。 含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。 可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。 胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。 猪的胚胎干细胞克隆系， 牛的胚胎干细胞。 ES细胞成为个体 1.将ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体转基因动物。 2.通过核移植将ES导入去核的卵母细胞，在子宫种植发育成个体 胚胎干细胞转基因过程 5.移植 优点：整合率高 同源重组实现定点整合，而非随机整合 缺点：不容易建立胚胎干细胞系 长期培养，导入外源基因的胚胎干细胞会由于细胞分化使生产的动物成为嵌合体 第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长 4.精子载体导入法 将外源DNA与破坏细胞膜的精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA