富血小板血浆对牙髓细胞增殖及矿化影响的实验研究.pdf

富血小板血浆对人牙髓细胞增殖及矿化 影响的实验研究 摘 要 目的： 探讨不同浓度富血小板血浆(Platelet rich plasma, PRP)对体外培养的人 牙髓细胞（human dental pulp cells，HDPCs）增殖及矿化作用的影响。 方法： 1. HDPCs 培养及鉴定：牙髓细胞来源于临床因正畸或阻生而拔除的健康年轻恒 牙，采用组织块法进行原代培养，并计算组织块法培养成功率；观察 HDPCs 的生长情况及细胞形态；细胞波形丝蛋白(Vimentin)及角蛋白(CK)免疫组化 染色鉴定细胞来源；绘制细胞生长曲线，测定细胞倍增时间；体外连续培养 HDPCs 30d 后Von Kossa 染色观察细胞形成钙结节能力。 2. PRP 制备及细胞增殖检测：两步离心法制备 PRP，血常规分析仪检测全血及 PRP 中血小板浓度，ELISA 方法测定全血及 PRP 中血小板源性生长因子 (PDGF-AB)和转化生长因子(TGF-β1)的浓度；采用四唑盐比色法（MTT）观察 不同浓度的PRP 培养HDPCs 2d 和4d 后细胞的增殖情况。 3. 细胞矿化能力检测：分组培养 HDPCs 3d 和 6d 后测定牙髓细胞碱性磷酸酶 （ALP）活性；采用电化学发光法检测细胞培养8d，12d和 16d后上清液骨钙 素(OCN)的含量；连续培养HDPCs 30d 后，采用茜素红染色的方法来观察各组 细胞形成矿化结节能力，并利用Photoshop 软件测定各组钙化结节的面积。 结果： 1. 本实验组织块法培养原代细胞成功率为 40%；免疫组化染色显示 Vimentin 染色阳性，CK 染色为阴性，提示细胞来源于中胚层；体外培养的人牙髓细胞 增殖较快，细胞倍增时间为44.42h，连续培养HDPCs 30d 后细胞能形成矿化 结节，Vonkossa 染色呈阳性。 9 2. 两步离心法制备的 PRP 中血小板的浓度大于 1000×10 个/L，为全血中的 4 倍以上，经ELISA 的方法测定PRP 中PDGF-AB 和TGF-β1 的浓度亦为全血的 4 倍以上。MTT 法测定不同浓度组的 PRP 对 HDPCs 均有促进增殖作用，以 10%PRP增殖效应最明显，4d时PRP对细胞的增殖作用明显强于2d时， 10%PRP 组较 10%胎牛血清组增殖作用明显。 3. 加入不同浓度的PRP 培养HDPCs 3d 和6d 后，牙髓细胞ALP 活性明显降低， P0.05；在DMEM 中加入 10%PRP培养8d，12d及 16d后，细胞OCN 浓度与DMEM 组相比差异无显著性，而在 10%FBS中加入 10%PRP培养8d、12d及 16d后OCN 含量明显下降，P0.05；实验组中加入 10%PRP 连续培养 30d 后，与对照组 （10%FBS）相比矿化结节面积减小，差异具有显著性。 结论： 本实验体外培养的HDPCs 具有较好的体外增殖及形成矿化结节的能力；两步 离心法制备的PRP 含有较高浓度的PDGF-AB 及TGF-β1,不同浓度的PRP 均能有 效促进牙髓细胞增殖，以 10%PRP 浓度增殖效应最明显；PRP 能抑制牙髓细胞矿 化。 关键词 人牙髓细胞，富血小板血浆，生长因子，细胞增殖，矿化 THE EFFECT OF PLATELET RICH PLASMA ON HUMAN PULP CELLS PROLIFERATION AND MINERALIZATION Abstract Purpose: The aim of this study was to evaluate the effect of different concentrations platelet rich plasma（PRP）on human dental pulp cells(HDPCs) proliferation and mineralizatio