酪氨酸蛋白激酶涎腺腺样囊性癌的关系的初步研究.pdf

中文摘要 实验目的 adenoid 涎腺腺样囊性癌(salivary cystic 部常见的恶性肿瘤之～，约占全部涎腺肿瘤的9．95％，占涎腺恶性肿瘤的 24％，平均为第二位的涎腺恶性肿瘤。腺样囊性癌是一种侵袭性很强的肿 瘤，远处转移发生率较高，早期就出现肺转移，严重地危害患者的生命健康。 kinase，TPK)是近年来的研究热点，大多 酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein 数生长因子受体具有酪氨酸激酶活性，当其与生长因子配体结合则发生自 磷酸化，使TPK激活并将生长因子刺激信号向胞内传递。TPK不仅参与激 素和生长因子等胞外信息的传递，还与细胞的恶变和增殖有关。 目前有关涎腺腺样囊性癌发生发展的机理仍不甚清楚，临床上缺少有 效的治疗药物。本实验采用免疫组化及WesternBlot技术，研究两种受体 型酪氨酸蛋白激酶EGFR及ErbB一2在涎腺腺样囊性癌组织及两个细胞系 中的表达，探讨EGFR及ErbB一2与腺样囊性癌发生发展的关系。本实验 作用及其对细胞增殖周期的影响，并且检测凋亡相关基因及周期蛋白的表 达变化，从而探讨TPK与涎腺腺样囊性癌的关系，为深入研究涎腺腺样囊 性癌的发病机理及临床更有效的治疗该肿瘤提供新的思路。 实验材料与方法 1．细胞培养 养基在37。C，5％CO：饱和湿度的孵箱中培养。 2．MTF检测法 X 96孔板咿以每孔0．5 104个细胞的密度接种200p．1单细胞悬液，培养 试剂20卜L／孔，37。C，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每 算细胞存活率。 细胞存活率=处理组OD值／对照组OD值X100％ 3．显微照相记录genistein对细胞生长状态及形态学的影响：倒置显微 镜下观察各组细胞的生长状态及形态学变化，随时显微照相。 4．流式细胞仪测定细胞周期 取培养的已传代后贴壁的细胞系，先血清饥饿24小时，然后加入220 l工mol／1 收集贴壁生长的细胞制成单细胞悬液，PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)染 液，避光4℃作用20一30分钟，上流式细胞仪检测。 5．AnnexinV／PI法定量检测细胞凋亡 细胞处理方法同上，收集所有细胞制成单细胞悬液，冷PBS洗2次，然 X 后以1 106／ml的浓度将细胞重悬于结合缓冲液中；再将100出溶液(1× PI，轻轻混匀，避光室温下孵育15分钟，每管加入400一结合缓冲液，--tJ, 时内上流式细胞仪检测。 6．Western印迹分析 样品采用考马斯亮蓝法定量蛋白。SDS—PAGE分离，硝酸纤维素膜2 小时，用酶显法，加显色剂显色。 7．免疫组化 收集SACC标本54例，正常涎腺组织9例。标本均经10％中性福尔马 林固定，制成3p,m厚的石蜡切片。免疫组化采用链霉素抗生物素一过氧化 物酶法(S—P)法。 实验结果 抗增殖作用 ’ ·2· 一83细胞株生长，并且这种抑制作用随着作用时间的延长和药物浓度的增 大而逐渐增强(P0．01)。 增加，细胞形态出现不规则，细胞变圆，体积缩小，胞质回缩，细胞表面出现 小突起及泡状结构，且细胞从培养瓶瓶壁脱落，悬浮细胞逐渐增多。 G，／M期细胞的大量增加(PO．01)。 genistein作用72小时，总凋亡率达到51．62％。 的机制 1．Western印迹经灰度值分析，220p,mol／1 0．01)。 2．Western印迹经灰度值分析，220pmol／1 Bd一2表达量较对照组显著减少，分别是对照组的87％，77％和85％(P ． 0．C5或P0．01)。 3．Western印迹经灰度值分析，220pmol／1 (P0．0