低盐胁迫下凡纳滨对虾消减cDNA文库构建及其谷氨酰胺合成酶cDNA克隆与表达.pdf

低盐胁迫下凡纳滨对虾消减cDNA文库构建及谷氨酰胺 合成酶cDNA克隆和表达 摘要 subtractive 本研究采用抑制性消减杂交(suppression 了低盐胁迫诱导下凡纳滨对虾肝胰腺消减cDNA文库，对eDNA文库中差异表达序 列标签(ESTs)进行同源比对、功能分类和鉴定分析，进一步对文库中差异表达的谷氨 酰胺合成酶(glutamine 盐胁迫对凡纳滨对虾GS的时空表达、GS活性、谷氨酰胺含量、血淋巴氮代谢的影 响。研究结果如下： 1．低盐胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺消减cDNA文库构建及差异ESTs分析 文库中的克隆测序后获得162个有效ESTs，经CP3在线拼接后获得21 comigs 和110 个非重复序列与Genbank中的已知基因的序列有较高的同源性。 蛋白质代谢及过程、碳水化合物代谢及能量产生、转运、细胞生长和凋亡、细胞防疫 和体内平衡、信号转导及其他，所占比例分别为所占比例分别为27．5％、15．0％、17．5％、 10．0％、12．5％、7．5％、10．O％。蛋白质代谢及过程类序列所占比例最高，其次为转运 类序列。 2．凡纳滨对虾谷氨酰胺合成酶的eDNA克隆及序列分析 EST设计特异性引物，采用cDNA 本实验根据消减cDNA文库中筛选获得的GS cDNA全长序列，共计1455 末端快速扩增法成功克隆了凡纳滨对虾GS bp，包括56bp 5，非编码区，1101 3’非编码区。阅读框共编码366氨基酸， bp阅读框以及298bp 分子量计算值为40．92kDa，理论等电点为6．34，氨基酸序列有两个模式位点，分别 aa和243．259aa。序列多重比对结果表明，凡纳滨对虾GS氨基酸序列有 位于61．81 5处保守位点，与中国明对虾同源性达93％、与眼斑龙虾GS同源性达86％及与长牡 蛎同源性达73％。采用NJ法构建的GS系统进化树表明，LvGS分类地位处于无脊椎 动物支，与无脊椎动物亲缘性较近，与脊椎动物亲缘性较远。 3．低盐胁迫对凡纳滨对虾GS表达量、活性、谷氨酰胺含量和氮代谢的影响 mRNA表达量上调，心脏、肌肉和眼 低盐胁迫诱导下肝胰腺、肠、鳃和胃中GS 柄中GSmRNA表达量下调。低盐胁迫下，肝胰腺中LvGS表达量先升高后下降，LvGS 表达量在6h、12h、ld和2d显著高于对照组(尸O．05)；肝胰腺中GS活性和谷氨酰 胺含量有先升高后降低的趋势，与对照组差异不显著；血淋巴总蛋白和血氨有先降低 I 后升高的趋势，与对照组差异不显著；血淋巴尿素氮有先升高后降低的趋势，低盐胁 迫下3h和12 h，血淋巴尿素氮显著高于对照组(PO．05)；血淋巴尿酸有先升高后降 低的趋势，低盐胁迫下3h、6h、12h、2d和3 d，血淋巴尿酸显著高于对照组衅0．05)。 d d．30 LvGS表达量、GS活性、谷氨酰胺含量、血氨、尿酸和尿素在低赫胁迫下7 趋于恢复正常水平。 关键字：凡纳滨对虾；肝胰腺；低盐胁迫；抑制性消减杂交；谷氨酰胺合成酶 II cDNA and Constructionofa